從人B細胞產生的具有甲型流感病毒中和活性的結合分子制造技術

本發明專利技術涉及產生于人B細胞的具有甲型流感病毒中和活性的結合分子，根據本發明專利技術的具有甲型流感病毒中和活性的結合分子是這樣的結合分子，其產生自從感染甲型流感病毒之患者的血液中選擇的B細胞，并且具有針對甲型流感病毒的中和活性，因而可用于預防和治療來源于甲型流感病毒的疾病，并且可用于通過使用根據本發明專利技術的結合分子來診斷流感病毒。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】從人B細胞產生的具有甲型流感病毒中和活性的結合分子
本專利技術涉及具有針對甲型流感病毒之中和活性的人單克隆抗體，其來源于人B細胞，所述人B細胞選擇自從甲型流感病毒的感染中恢復的患者的血液。
技術介紹
流感是由流感病毒的呼吸系統感染引起的疾病，常發生在冬季。已知流感具有很高的感染性，并且影響所有年齡組，特別是老年人(TreanorJ，2004，NEnglJMed.350(3)：218-20)。流感病毒是包膜的RNA(核糖核酸)病毒，屬于正粘病毒(Orthomyxoviridae)科，具有由八個反義單鏈RNA(核糖核酸)區段構成的基因組。這些流感病毒被劃分為甲型、乙型和丙型。根據其主要表面蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)，甲型流感病毒被進一步劃分為亞型。到目前為止，已經鑒別了16種HA和9種NA(CheungTK和PoonLL2007，AnnNYAcadSci1102：1-25)。流感病毒可根據其類型影響鳥、豬和人，并且具有由RNA區段構成的基因組，因為這個原因，其基因可連續地突變和重組，產生新的遺傳改變(TreanorJ，2004.NEnglJMed.350(3)：218-20)。由于這種連續的突變，難以獲得針對流感病毒的永久免疫力，因此目前被認為最有效的預防方法是這樣的方法，每年施用針對預計將流行之特定類型的流感病毒的疫苗以每年產生針對流感病毒的免疫力。針對流感病毒的疫苗通常使用卵產生，但該生產方法是耗時且低效的方法。因此，該方法的問題在于難以每年在有限的時間框架內生產足夠量的疫苗。為了解決這一問題，幾家藥物公司(GSK、Baxter等)已經積極地進行了通過細胞培養產生疫苗的方法的研究。此外，如果發生流感病毒感染大流行，則在短時間內開發針對感染的疫苗是非常困難的。而且，由于與耐藥性突變病毒出現相關的問題，抗病毒藥物并非完全可靠的。為了克服這個問題，最近已積極地開發了針對流感病毒的抗體(Throsby等，2008，PloSOne3(e3942)；Sui等，2009，Naturestructural&molecularbiology16(265-273)；Simmons等，2007，PloSMedicine4(e178)；Wrammert等，2011，JExpMed.208(181-193)；Corti等，2011，Science333(850-856))。來自恢復患者的血液產物已經被用于治療感染多種病毒的患者，以及用于治療流感感染大流行。例如，當感染西班牙流感病毒的患者具有肺炎癥狀時，收集自從流感病毒感染恢復之患者的血液產物被用于治療流感病毒(Luke等，2006.Annalsofinternalmedicine.145：599)。因此，從人血漿中純化超免疫球蛋白(IgIv)并用于治療感染多種病毒的患者，但如上所述獲得的產物由于血液中潛在的感染原而可能是不安全的，并且對于大量生產是低效的。人B細胞被用于篩選特定人單克隆抗體。然而，通過EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)永生化人B細胞的效率較低且耗時。為了克服這一缺點，已經開發并使用了新技術。這些技術之一是利用RT-PCR法直接從B細胞獲得抗體的遺傳信息。例如，有一種方法包括：對表達針對特定抗原之抗體的B細胞進行染色，使用FACS分選儀分離B細胞，通過RT-PCR方法從單個B細胞獲得抗體的遺傳信息，將所述遺傳信息插入到表達載體中，并將所述表達載體轉染到動物細胞中以產生大量抗體。為了以更簡便且更快速的方式進行該生產方法，可以使用以下技術。新技術“芯片上的免疫斑點陣列測定”(immunospotarrayassayonachip，ISAAC)能夠在幾周內通過篩選單個B細胞(分泌特定單克隆抗體)獲得抗體基因(Jin等.，2009NatMed.15，1088-1092)。這樣獲得的抗體是天然人抗體，其在免疫原性問題方面可以更有效。公開內容技術問題本專利技術的一個目的是提供具有針對甲型流感病毒之中和活性的結合分子。本專利技術的另一個目的是提供編碼所述結合分子的分離的核酸分子。本專利技術的另一個目的是提供具有插入其中的所述分離的核酸分子的表達載體。本專利技術的另一個目的是提供用表達載體轉染的產生結合分子的細胞系。本專利技術的另一個目的是提供用于篩選結合分子的方法。本專利技術的另一個目的是提供包含所述結合分子的組合物。本專利技術的另一個目的是提供使用所述結合分子治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本專利技術的另一個目的是提供使用所述結合分子預防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本專利技術的另一個目的是提供使用所述結合分子診斷甲型流感病毒感染的方法。本專利技術的另一個目的是提供用于診斷甲型流感病毒的試劑盒，其包含所述結合分子。技術方案為了實現以上目的，本專利技術提供了具有針對甲型流感病毒的中和活性的結合分子。本專利技術還提供了編碼所述結合分子的分離的核酸分子。本專利技術還提供了具有插入其中的所述分離的核酸分子的表達載體。本專利技術還提供了用所述表達載體轉染的產生結合分子的細胞系。本專利技術還提供了用于篩選結合分子的方法。本專利技術還提供了包含所述結合分子的組合物。本專利技術還提供了用于預防和治療由甲型流感病毒引起的疾病的組合物，其包含所述結合分子。本專利技術還提供了用于診斷甲型流感病毒的組合物，其包含所述結合分子。本專利技術還提供了使用所述結合分子治療由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本專利技術還提供了使用所述結合分子預防由甲型流感病毒引起的疾病的方法。本專利技術還提供了使用所述結合分子診斷甲型流感病毒感染的方法。本專利技術還提供了用于診斷甲型流感病毒的試劑盒，其包含所述結合分子。有益效果本專利技術的結合分子具有對甲型流感病毒的結合親和力和針對其的中和活性，因而可用于預防和治療由甲型流感病毒引起的疾病，并且也可用于診斷甲型流感病毒感染。附圖說明圖1是一組圖，其示出為了確認初步篩選的結合分子對H3血凝素(下文稱作“HA”)的結合親和力而進行的ELISA的結果。圖2示出載體pCT145(A)和pCT147(B)的圖譜。A：pCT145載體；B：pCT147載體；pac：編碼嘌呤霉素N-乙?；D移酶(PAC)的基因；以及DS：二重對稱(dyadsymmetry)序列(EBNA1結合oriP中的二重對稱(DS)元件)圖3是表達本專利技術之結合分子的表達載體的圖譜。圖4示出使用本專利技術的結合分子進行的動物(小鼠)實驗結果。圖5示出在使用本專利技術的結合分子進行動物(雪貂)實驗期間，測量感染H3N2(A/香港/68)流感病毒后鼻洗液和肺組織中病毒滴度改變的結果。圖6示出在使用本專利技術的結合分子進行動物(雪貂)實驗期間，測量感染H5N1(A/越南/1203/04)流感病毒后鼻洗液和肺組織中病毒滴度改變的結果。最佳方式下文中，將如下定義本文所使用的術語。本文所用的術語“甲型流感病毒”指屬于正粘病毒科并且具有由八個反義單鏈RNA(核糖核酸)區段構成的基因組的包膜病毒。這些流感病毒被劃分為甲型、乙型和丙型，并且根據其主要表面蛋白HA(血凝素)和NA(神經氨酸酶)，甲型流感病毒被進一步劃分為亞型。到目前為止，已經報道了16種HA和9種NA。本文所用的表達“H3亞型病毒”指具有H3亞型HA的病毒，并且因而旨在包括H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H本文檔來自技高網...

【技術保護點】
具有針對甲型流感病毒之中和活性的結合分子。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.09.30 KR 10-2011-00996461.具有針對甲型流感病毒之中和活性的結合分子，其中所述結合分子由以下輕鏈和重鏈構成，所述輕鏈包含根據Kabat方法確定的SEQIDNO：7所示CDR1區，SEQIDNO：8所示CDR2區和SEQIDNO：9所示CDR3區；所述重鏈包含根據Kabat方法確定的SEQIDNO：10所示CDR1區，SEQIDNO：11所示CDR2區和SEQIDNO：12所示CDR3區。2.權利要求1所述的結合分子，其中所述結合分子由輕鏈和重鏈構成，所述輕鏈包含SEQIDNO：39所示多肽序列，所述重鏈包含SEQIDNO：40所示多肽序列。3.權利要求1所述的結合分子，其中所述結合分子具有針對選自以下任一種的中和活性：甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亞型。4.具有針對甲型流感病毒之中和活性的結合分子，其中所述結合分子由以下輕鏈和重鏈構成，所述輕鏈包含由根據Kabat方法確定的SEQIDNO：24所示CDR1區編碼的多肽序列，由SEQIDNO：25所示CDR2區編碼的多肽序列和由SEQIDNO：26所示CDR3區編碼的多肽序列；所述重鏈包含由根據Kabat方法確定的SEQIDNO：27所示CDR1區編碼的多肽序列，由SEQIDNO：28所示CDR2區編碼的多肽序列和由SEQIDNO：29所示CDR3區編碼的多肽序列。5.權利要求4所述的分子，其中所述結合分子由輕鏈和重鏈構成，所述輕鏈包含由SEQIDNO：47所示多核苷酸序列編碼的多肽序列，所述重鏈包含由SEQIDNO：48所示多核苷酸序列編碼的多肽序列。6.權利要求4所述的結合分子，其中所述結合分子具有針對選自以下任一種的中和活性：甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9亞型。7.權利要求1或4所述的結合分子，其中所述結合分子是抗體或抗體片段。8.權利要求7所述的結合分子，其中所述抗體或抗體片段是Fab片段、Fv片段、雙抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。9.分離的核酸分子，其編碼根據權利要求1或4所述的具有針對甲...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張宸在，權起圣，李癸淑，李炫周，全在原，全晃槿，張珉碩，
申請(專利權)人：賽特瑞恩股份有限公司，
類型：發明
國別省市：韓國;KR