包含重組人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的組合物和制劑及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了包含重組艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)的組合物。所述IDS組合物的糖基化模式和甲酰甘氨酸含量不同于Elaprase，并且所述IDS組合物具有更好的藥效且與常規(guī)藥劑相比更安全，因此可有效地用于治療亨特綜合征(Hunter?syndrome)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及用于治療亨特綜合征(Hunter syndrome)的組合物(其包含重組人艾杜糖醒酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase,下文中稱為“ IDS”))、包含所述組合物的制劑、以及用于制備所述組合物和制劑的方法。更特別地，根據(jù)本專利技術(shù)的用于治療亨特綜合征的組合物包含具有SEOID NO:1所示氨基酸序列的IDS作為活性成分，其中位于SEO ID NO:1之IDS氨基酸序列中第59位的半胱氨酸殘基以65%或更高的摩爾比、優(yōu)選以75%或更高的摩爾比、更優(yōu)選以80%或更高的摩爾比轉(zhuǎn)化為甲酰甘氨酸(FGly:2_氨基-3-氧代丙酸)。此外，包含在用于治療亨特綜合征的組合物中的IDS含有量為2.0至4.0摩爾(優(yōu)選量為2.3至3.5摩爾，更優(yōu)選量為2.5 至 3.0 摩爾)/ 摩爾 I DS 的甘露糖-6-憐酸(mannose-6-phosphate)。用于制備根據(jù)本專利技術(shù)的用于治療亨特綜合征之組合物的方法包括:(I)對(duì)用編碼由SEO ID NO:1所示之IDS的基因轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，并獲得培養(yǎng)物；和(2)通過陰離子交換色譜、疏水色譜、陽(yáng)離子交換色譜和親和色譜對(duì)該培養(yǎng)物進(jìn)行，其特征在于，所述重組細(xì)胞株是在水解產(chǎn)物存在下進(jìn)行培養(yǎng)，并且所述陽(yáng)離子交換色譜使用PH4.0 至6.0的洗脫緩沖液來(lái)進(jìn)行。由于與常規(guī)產(chǎn)品相比在安全性和藥效方面具有優(yōu)勢(shì)，所以包含IDS的治療組合物以及包含所述組合物的制劑可有效地用于治療亨特綜合征。
技術(shù)介紹
亨特綜合征或黏多糖忙積癥II型(mucosaccharidosis type II)是溶酶體忙積癥(lysosomal storage disease, LSD),其中黏多糖(也稱為糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG))因IDS缺乏而未正確分解并在身體內(nèi)累積。隨著GAG繼續(xù)在身體各處細(xì)胞中累積，亨特綜合征的多種征兆變得更加明顯。患有亨特綜合征的一些人的身體表現(xiàn)包括明顯的面部特征和大的頭部。亨特綜合征中具有代表性的癥狀是由于肝腫大或脾腫大而增大的腹部、耳聾、瓣膜性心臟病(valvular heart disease)、阻塞性呼吸道疾病(obstructive airway disease)以及睡眠呼吸暫停。此外，亨特綜合征可影響主要關(guān)節(jié),導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬和運(yùn)動(dòng)受限。在亨特綜合征的一些病例中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受牽連導(dǎo)致發(fā)育延緩和神經(jīng)系統(tǒng)問題。已知亨特綜合征的發(fā)生率為I / 162，000并且是染色體X-連鎖的隱性形式的遺傳病，因此給患者及家人帶來(lái)極大痛苦。因此，關(guān)于亨特綜合征的治療已經(jīng)進(jìn)行了多種試驗(yàn)，包括骨髓移植、酶替代和基因治療。雖然骨髓移植能夠終止大多數(shù)癥狀，但是難以找到與所有患者匹配的HLA(人白細(xì)胞抗原)。此外，骨髓移植是伴隨有若干副作用的外科大手術(shù)，這樣的副作用包括如果HLA不是匹配的，則患者的生命將處于高風(fēng)險(xiǎn)中。用于亨特綜合征的基因治療借助于病毒載體(例如腺病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒)或非病毒載體將正常的IDS基因遞送到體內(nèi)。然而,基因治療仍只是實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并沒有在臨床上應(yīng)用。至于用于亨特綜合征的酶替代治療，其施用在外部產(chǎn)生的IDS并且優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)單。然而，酶替代必須持續(xù)進(jìn)行，這會(huì)帶來(lái)高費(fèi)用。使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的Elaprase? (shire Pharmaceuticals Group)被FDA批準(zhǔn)作為用于亨特綜合征的酶替代治療劑。然而，該藥物非常昂貴且存在效果和安全性差的缺點(diǎn)。如上所述，盡管已經(jīng)開發(fā)了多種用于亨特綜合征的治療，但是仍迫切需要表現(xiàn)出高療效及高安全性的新治療和藥劑(agent)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
技術(shù)問題本專利技術(shù)的一個(gè)目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中遇到的問題并提供用于治療亨特綜合征的組合物和包含該組合物的制劑，所述組合物包含作為活性成分的重組IDS，所述重組IDS保證高的療效和安全性并通過改進(jìn)的培養(yǎng)和純化過程來(lái)生產(chǎn)。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供用于制備用于治療亨特綜合征之組合物和包含所述組合物之制劑的方法。問題的解決方案為了實(shí)現(xiàn)上 述目的，本專利技術(shù)提供用于治療亨特綜合征的組合物，其包含具有SEOID NO:1所示氨基酸序列的重組IDS作為活性成分，其中在59位的半胱氨酸殘基以65%或更高的摩爾比、優(yōu)選以75%或更高的摩爾比、更優(yōu)選以80%或更高的摩爾比轉(zhuǎn)化為甲酰甘氨酸(FGly)。IDS (在本文中還稱為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶或I2S)在從人的肝、腎或胎盤分離和純化時(shí)具有 56kDa 的分子大小(Bielicki, J 等(1990)Biochem, J.,271:75 ~86)。IDS作為550個(gè)氨基酸的單體蛋白質(zhì)而表達(dá)，并且在切割掉25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽之后作為525個(gè)氨基酸的成熟活性蛋白質(zhì)而分泌到培養(yǎng)基中。IDS的分子量隨著糖基化而變化，并且發(fā)現(xiàn)在用內(nèi)切糖苷酶F處理后范圍為約60至90kDa，如通過SDS-PAGE所測(cè)量的。IDS包含兩個(gè)二硫鍵和八個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)，并且在經(jīng)過翻譯后修飾之后作為糖蛋白而產(chǎn)生，在上述翻譯后修飾中，N-連接的糖基化位點(diǎn)在真核生物中被復(fù)合的、雜合的和高甘露糖型寡糖鏈所占據(jù)。IDS 一旦分泌到培養(yǎng)基中，就可以在經(jīng)過典型分離和純化過程之后作為藥物使用。IDS可以是具有多種糖基化模式的糖蛋白形式，這取決于多種因素，包括例如，IDS基因重組、轉(zhuǎn)化(例如，所使用的細(xì)胞系)、培養(yǎng)和純化技術(shù)。在本專利技術(shù)中，公開了甘露糖-6-磷酸(M6P)的含量和CyS-59向FGly的轉(zhuǎn)化率對(duì)IDS的療效和安全性具有重大影響。甘露糖-6-磷酸(M6P)殘基的存在允許酶與細(xì)胞表面的M6P受體特異性結(jié)合，導(dǎo)致酶的細(xì)胞內(nèi)化，溶酶體的靶向和積聚的GAG的后續(xù)分解代謝。IDS的生物活性還取決于保守的半胱氨酸(第59位)向甲酰甘氨酸的后修飾。除非另有說明，否則本文使用的術(shù)語(yǔ)“IDS”是指與碳水化合物相連的IDS蛋白質(zhì)，SP，糖基化IDS。本專利技術(shù)的IDS優(yōu)選地具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但不限于此。對(duì)于本領(lǐng)域中具有普通知識(shí)的那些人(下文中稱為“普通技術(shù)人員”)而言應(yīng)顯而易見的是，只要使IDS保留期望的活性，那么其中在SEQ ID NO:1的氨基酸序列的一些氨基酸殘基上發(fā)生突變(例如插入、缺失和替換)的任何氨基酸序列均落入本專利技術(shù)的范圍內(nèi)。本文使用的術(shù)語(yǔ)IDS的“糖基化模式”是指與所得IDS的8個(gè)糖基化位點(diǎn)結(jié)合的寡糖的特征(例如，寡糖的糖基化位點(diǎn)和種類)。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在根據(jù)本專利技術(shù)用于治療亨特綜合征之組合物中的IDS具有與已知的(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列，但是具有不同的糖基化模式和不同的第59位半胱氨酸向甲酰甘氨酸的轉(zhuǎn)化率，如上所述(參照實(shí)施例1-5和1-6)。換言之，在根據(jù)本專利技術(shù)的用于治療亨特綜合征之組合物中使用的IDS具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列，其在第59位的半胱氨酸以65%或更高的摩爾比、優(yōu)選以75%或更高的摩爾比、更優(yōu)選以80%或更高的摩爾比向甲酰甘氨酸(FGly)轉(zhuǎn)化，而Elaprase的轉(zhuǎn)化率為約50% (Genet Med2006:8(8):465-473)。已知甲酰甘氨酸密切參與IDS降解底物的能力(即IDS的活性)。因此，因?yàn)楸緦＠夹g(shù)的組合物不同于常規(guī)藥劑Elaprase，所以根據(jù)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于治療亨特綜合征的組合物，其包含具有SEQ?ID?NO：1的氨基酸序列的IDS作為活性成分，其中在所述IDS氨基酸序列中第59位的半胱氨酸殘基以65％或更高的摩爾比轉(zhuǎn)化為甲酰甘氨酸(FGly)。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專利技術(shù)】2012.02.08 KR 10-2012-0012718;2011.06.24 US 61/501.用于治療亨特綜合征的組合物，其包含具有SEQID NO:1的氨基酸序列的IDS作為活性成分，其中在所述IDS氨基酸序列中第59位的半胱氨酸殘基以65 %或更高的摩爾比轉(zhuǎn)化為甲酰甘氨酸(FGly)。2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中在所述IDS氨基酸序列中第59位的半胱氨酸殘基以75%或更高的摩爾比轉(zhuǎn)化為FGly。3.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述具有SEQID NO:1氨基酸序列的IDS含有量為2.0至4.0摩爾/摩爾IDS的甘露糖-6-磷酸。4.權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述具有SEQID NO:1氨基酸序列的IDS含有量為2.5至3.0摩爾/摩爾IDS的甘露糖-6-磷酸。5.用于治療亨特綜合征的制劑，其包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的組合物。6.權(quán)利要求5所述的制劑，其包含: 可藥用載體；和 選自以下的物質(zhì):緩沖劑、碳水化合物、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑、輔藥、助懸劑、增稠劑和防腐劑。7.用于制備用于治療亨特綜合征之組合物的方法，其包括: (1)對(duì)用編碼SEOID NO:...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳東奎，鄭堯景，白相勛，樸裕昌，徐辰旭，崔龍?jiān)?/a>，孫鍾文，金龍哲，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：株式會(huì)社綠十字，株式會(huì)社醫(yī)用基因生物，
類型：
國(guó)別省市：