霉菌發(fā)酵生物合成制備霉菌氧化物的工藝及所用新型氮源制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種甾體激素類藥物霉菌發(fā)酵合成制備霉菌氧化物的工藝及所需新型氮源，配合新型氮源，在27±3℃攪拌反應(yīng)，并在生物發(fā)酵過程中進行通氣，經(jīng)24-72h氧化反應(yīng)，再經(jīng)板框壓濾脫水、吹干，將底物沃氏氧化物轉(zhuǎn)化為含有霉菌氧化物的菌絲體，再經(jīng)丙酮提取得到霉菌氧化物粗品，經(jīng)甲苯、氯仿混合溶劑精制得到霉菌氧化物精品，新型氮源的配方更加適合生物發(fā)酵工藝要求，收率可達92%以上，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)量高、轉(zhuǎn)化率、收率相關(guān)指標高，經(jīng)濟效益可觀，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及留體激素類藥物霉菌發(fā)酵領(lǐng)域，具體為一種霉菌發(fā)酵生物合成制備霉菌氧化物的工藝及所需新型氮源。
技術(shù)介紹
環(huán)氧黃體酮呈白色結(jié)晶粉末狀，無臭，溶于甲醇，甲苯等有機溶劑。由天然甾體薯蕷皂素經(jīng)過開環(huán)、乙酰化、氧化、水解、消除、環(huán)氧化、氧化等反應(yīng)制得，廉價易得，是我國用量最大的一類非常重要的留體藥物中間體，廣泛應(yīng)用于腎上腺皮質(zhì)激素藥物的合成，是氫化可的松、可的松、強的松，地塞米松和膚輕松等留體激素類藥物的主要原料。1952年，美國普強制藥公司的Murray等首次利用黑根霉將黃體酮轉(zhuǎn)化為Ila—羥基黃體酮，解決了皮質(zhì)激素合成中的關(guān)鍵問題，且轉(zhuǎn)化率有90%以上，反應(yīng)專一性強，是化學(xué)方法無法比擬的，使得人們開始認識到微生物轉(zhuǎn)化在留體藥物生產(chǎn)中的重要性。隨后，研究者又相繼發(fā)現(xiàn)了細菌、放線菌、酵母和霉菌的某些菌種可使留體化合物的特定部位發(fā)生有價值的轉(zhuǎn)化，許多化學(xué)方法難以進行的反應(yīng)，利用微生物轉(zhuǎn)化可以輕而易舉地實現(xiàn)，從而促使了生物催化和生物轉(zhuǎn)化這一新領(lǐng)域的興起，也促進了留體藥物工業(yè)的迅速發(fā)展。黑根霉微生物轉(zhuǎn)化，是指利用黑根霉細胞(酶)對沃氏氧化物Cll位(基團)進行特定的羥化反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化成結(jié)構(gòu)上相類似的更有價值的新化合物霉菌氧化物。其轉(zhuǎn)化的最終產(chǎn)物不是黑根霉細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝產(chǎn)物，而是黑根霉細胞酶系對底物的Cll位進行催化反應(yīng)后的產(chǎn)物。由于采用微生物轉(zhuǎn)化法能夠減少合成步驟，縮短生產(chǎn)周期，提高收率，減少副反應(yīng)，而且反應(yīng)迅速、專一，條件溫和，有立體選擇性和區(qū)域選擇性，因此利用微生物轉(zhuǎn)化具有重要的現(xiàn)實意義。目前，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，如羥化反應(yīng)已成為許多留體激素藥物或其中間體合成路線中不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)。留體微生物轉(zhuǎn) 化過程中一個重要的技術(shù)難點是如何提高轉(zhuǎn)化效率，該過程存在氮源中蛋白質(zhì)含量偏低，氨基酸組合配伍不夠合理，尤其是鐵離子含量低及存在可溶性磷離子等諸多缺陷，雖多年來工藝不斷改進，各項指標有所提高，但其轉(zhuǎn)化率、收率、指標并無大的突破。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)針對以上不足之處，提供了一種霉菌發(fā)酵生物合成制備霉菌氧化物的工藝及所需新型氮源，它是針對現(xiàn)有技術(shù)不足的一種改進，它是采用新型氮源彌補蛋白質(zhì)含量偏低，氨基酸配比不夠合理等缺陷的生物發(fā)酵工藝；它在保證現(xiàn)有產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，大幅度提高產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率、收率指標的重大突破，這是多年來各種改進所不能達到的。本專利技術(shù)解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是: 一種霉菌發(fā)酵生物合成制備霉菌氧化物的工藝，它包括以下步驟: (I)菌絲制備:A、將碳源:葡萄糖60 85kg ;氮源:玉米衆(zhòng)40 57kg ;蠶蛹粉10 20kg ;硫酸銨5 IOkg;新型氮源，新型氮源各組分在培養(yǎng)基中的終濃度設(shè)置為:蛋白胨:5%。，酵母浸膏:l%o, (NH4)2SO4:0.5%0，F(xiàn)eSO4.7H20:0.01g%。，NaCl:0.1%。，KH2PO4:1%0, MgSO4.7H20:0.2%o,吐溫80 1% ;消沫劑:聚醚1000 2000mL —次投入到一級發(fā)酵罐內(nèi)，加入I 4噸水，調(diào)整pH值至2 5，蒸汽滅菌，降溫至27±3°C時，接入黑根霉的孢子懸浮液3 50升，孢子懸浮液濃度為10 300萬/mL，通入空氣，所說的通入空氣和反應(yīng)液的體積比為0.21 0.28倍體積/min，攪拌12 36h，后移入二級發(fā)酵罐； B、按與一級發(fā)酵罐同樣的物料配比投5 10倍物料，經(jīng)滅菌，降溫至27±3°C，移入A步驟所制全部液體，通入空氣，所說的通入空氣和反應(yīng)液的體積比為0.21 0.28倍體積/min,攪拌18 36h,投入340kg底物沃氏氧化物,于25 30°C進行生物氧化,氧化反應(yīng)時間為24 72小時，取樣鏡檢，及色譜測試，底物轉(zhuǎn)化比例達到50 60%后，提高溫度至30 60°C，下口罐放料； C、將菌絲液體壓入板框壓混機，濾掉發(fā)酵液，將菌轉(zhuǎn)體空氣吹干,再將菌轉(zhuǎn)體粉碎； (2)霉菌氧化物粗品的制備:將粉碎后的菌絲體投入提取罐內(nèi)，加入菌絲體重量5 10倍丙酮，提取2 8次，將提取液濃縮結(jié)晶，得霉菌氧化物粗品； (3)霉菌氧化物精制:將霉菌氧化物粗品投入精制罐內(nèi)，加入霉菌氧化物粗品重量10 15倍體積的甲苯、氯仿混合溶媒，全溶濃縮，所說的甲苯、氯仿體積比為:1: 2 2: 1，反復(fù)精制3 9次，取樣測試，霉菌氧化物含量大于97%后，下口罐放料、濾干，精品入烤箱干燥，取樣送檢，霉菌氧化物含量大于97%為霉菌氧化物。本專利技術(shù)的反應(yīng)方程式是:本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種霉菌發(fā)酵生物合成制備霉菌氧化物的工藝，其特征在于：它包括以下步驟：（1）菌絲制備：A、將碳源：葡萄糖60～85kg；氮源：玉米漿40～57kg；蠶蛹粉10～20kg；硫酸銨5～10kg；新型氮源，新型氮源各組分在培養(yǎng)基中的終濃度設(shè)置為：蛋白胨：5‰，酵母浸膏：1‰，(NH4)2SO4?：0.5‰，F(xiàn)eSO4·7H2O：0.01g‰，NaCl：0.1‰，KH2PO4?：1‰，MgSO4·7H2O：?0.2‰，吐溫80?1%；消沫劑：聚醚1000～2000mL一次投入到一級發(fā)酵罐內(nèi)，加入1～4噸水，調(diào)整pH值至2～5，蒸汽滅菌，降溫至27±3℃時，接入黑根霉的孢子懸浮液3～50升，孢子懸浮液濃度為10～300萬/mL,通入空氣，所說的通入空氣和反應(yīng)液的體積比為0.21～0.28倍體積/min，攪拌12～36h,后移入二級發(fā)酵罐；B、按與一級發(fā)酵罐同樣的物料配比投5～10倍物料，經(jīng)滅菌，降溫至27±3℃，移入A步驟所制全部液體，通入空氣，所說的通入空氣和反應(yīng)液的體積比為0.21～0.28倍體積/min，攪拌18～36h，投入340kg底物沃氏氧化物，于25～30℃進行生物氧化，氧化反應(yīng)時間為24～72小時，取樣鏡檢，及色譜測試，底物轉(zhuǎn)化比例達到50～60%后，提高溫度至30～60℃，下口罐放料；C、將菌絲液體壓入板框壓混機，濾掉發(fā)酵液，將菌轉(zhuǎn)體空氣吹干，再將菌轉(zhuǎn)體粉碎；（2）霉菌氧化物粗品的制備：將粉碎后的菌絲體投入提取罐內(nèi)，加入菌絲體重量5～10倍丙酮，提取2～8次，將提取液濃縮結(jié)晶，得霉菌氧化物粗品；（3）霉菌氧化物精制：將霉菌氧化物粗品投入精制罐內(nèi)，加入霉菌氧化物粗品重量10～15倍體積的甲苯、氯仿混合溶媒，全溶濃縮，所說的甲苯、氯仿體積比為：1∶2～2∶1，反復(fù)精制3～9次，取樣測試，霉菌氧化物含量大于97%后，下口罐放料、濾干，精品入烤箱干燥，取樣送檢，霉菌氧化物含量大于97%為霉菌氧化物。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種霉菌發(fā)酵生物合成制備霉菌氧化物的工藝，其特征在于:它包括以下步驟: (1)菌絲制備: A、將碳源:葡萄糖60 85kg;氮源:玉米衆(zhòng)40 57kg ;蠶蛹粉10 20kg ;硫酸銨5 IOkg ;新型氮源，新型氮源各組分在培養(yǎng)基中的終濃度設(shè)置為:蛋白胨:5%。，酵母浸膏:1%0, (NH4)2SO4:0.5%0，F(xiàn)eSO4 7H20:0.01g%。，NaCl:0.1%。，KH2PO4:1%0, MgSO4 7H20:0.2%o,吐溫80 1% ;消沫劑:聚醚1000 2000mL —次投入到一級發(fā)酵罐內(nèi)，加入I 4噸水，調(diào)整pH值至2 5，蒸汽滅菌，降溫至27±3°C時，接入黑根霉的孢子懸浮液3 50升，孢子懸浮液濃度為10 300萬/mL，通入空氣，所說的通入空氣和反應(yīng)液的體積比為0.21 0.28倍體積/min，攪拌12 36h，后移入二級發(fā)酵罐； B、按與一級發(fā)酵罐同樣的物料配比投5 10倍物料，經(jīng)滅菌，降溫至27±3°C，移入A步驟所制全部液體，通 入空氣，所說的通入空氣和反應(yīng)液的體積比為0.21 0.28倍體積/min,攪拌18 36h,投入340kg底物沃氏氧化物,于25 30°C進行生物氧化,氧化反應(yīng)時間為24 72小時，取樣鏡檢，及色譜測試，底物轉(zhuǎn)化比例達到50 60%后，提高溫度...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：洪祥碧，李艷芳，
申請(專利權(quán))人：山東泰華生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：