表達重組人FVIII的整合質粒、細胞株及其構建方法和應用技術

一種表達重組人FVIII的整合質粒、細胞株及其構建方法和應用。該整合質粒包括：rAAV質粒骨架，以及連接于rAAV質粒骨架內的兩個ITR元件之間的B區缺失的FVIII基因。進一步的，該整合質粒中還可包含：GFP基因，用作后續細胞株的篩選標記；和/或，AAVp5啟動子，用以提高整合效率。該細胞株包括經過上述的整合質粒或上述方法構建的整合質粒以及用于表達AAVRep蛋白的質粒共轉染的，且能穩定表達BDD-FVIII的HEK293細胞。該細胞株可應用于生產人重組凝血因子VIII。本發明專利技術的優點包括：（1）避免了重組病毒構建及純化過程，更簡單易于操作，整合率高，且無重組病毒基因組的分子量限制，具有更廣泛的應用性；（2）以人HEK293細胞作為宿主，表達的FVIII蛋白的結構與功能更接近于天然FVIII蛋白。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種用于表達重組人凝血因子的載體、細胞株及其構建方法，特別是一種利用AAV定點整合構建表達重組人凝血因子VIII的293細胞株、其構建方法及應用。
技術介紹
血友病A ( hemophilia A)又名甲型血友病，是一種X-連鎖隱性遺傳病，在男性中的發病率約為(廣2) / 100001。為患者定期輸注血漿源性FVIII濃縮物或重組人凝血因子FVIII (rh FVIII)等FVIII制品是目前治療血友病的主要途徑。rh FVIII產品至今已應用20余年，但所有蛋白都是由中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或幼倉鼠腎細胞(BHK)生產。天然FVIII蛋白的表達經歷非常復雜的翻譯后修飾(post-translational modifications,PTMs)過程，而在非人細胞的表達系統中可能存在由于不正確的PTMs引起免疫反應或FVIII抑制劑的形成，進而導致替代療法失效。
技術實現思路
針對現有技術的不足，本專利技術的一個目的在于提供一種表達重組人凝血因子的整合質粒及其構建方法
本專利技術的另一目的在于提供一種表達重組人凝血因子的細胞株及其構建方法， 本專利技術的又一目的在于提供一種基于前述整合質粒和細胞株生產重組凝血因子VIII的方法。為實現上述發 明目的，本專利技術采用了如下技術方案: 一種表達重組人凝血因子的整合質粒，包括: rAAV質粒骨架，以及， 整合于所述rAAV質粒骨架中的B區缺失的FVIII基因。進一步的，所述B區缺失的FVIII基因連接于所述rAAV質粒骨架內的兩個ITR元件之間。優選的，所述整合質粒中還可包含用作后續細胞株的篩選標記的GFP基因和/或用以提高整合效率的AAV p5啟動子。作為較為優選的實施方案之一，所述rAAV質粒骨架包括rAAV質粒pTRP5⑶NFGFP備Nhel和AfeiI雙酶切去除⑶NF基因后所形成的rAAV質粒骨架。一種表達重組人凝血因子的整合質粒的構建方法，包括: 提供rAAV質粒骨架，并將B區缺失的FVIII基因連接至rAAV質粒骨架中，獲得目標產物。進一步的，該方法包括:將B區缺失的FVIII基因連接于所述rAAV質粒骨架內的兩個ITR元件之間； 所述rAAV質粒骨架包括rAAV質粒pTRP5⑶NFGFP經MeI和AfeiI雙酶切去除⑶NF基因后所形成的rAAV質粒骨架。一種表達重組人凝血因子的細胞株，包括經過上述整合質粒或上述方法構建的整合質粒以及用于表達AAV R印蛋白的質粒共轉染的，且能穩定表達BDD-FVIII的HEK 293細胞。作為較為優選的實施方案之一，所述用于表達AAV Rep蛋白的質粒包括PSVAV2質粒。一種重組人凝血因子的生產方法，包括: 培養如上所述的細胞株，而后收集培養產物，獲得目標產物。作為較為優選的實施方案之一，該方法具體包括: 將如上所述的細胞株置于適合培養HEK 293細胞的環境中，使所述細胞株長至80 90%，而后將所述細胞株無血清培養24h以上，收集培養上清，獲得目標產物。與現有技術相比，本專利技術至少具有如下優點: (1)避免了重組病毒構建及純化過程，更簡單易于操作，整合率高，且無重組病毒基因組的分子量限制，具有更廣泛的應用性； (2)以人細胞作為宿主，表達的FVIII蛋白的結構與功能更接近于天然FVIII蛋白。附圖說明圖1a是本專利技術一較佳實施例中rAAV整合質粒pTRP5BDDGFP的圖譜，該質粒是在張春構建的rAAV質粒pTRP5⑶NFGFP基礎上改造而成，以pZp9FVIII Λ BS質粒為模板(戚正武院士惠贈，參閱The Gene Expression of Coagulation Factor VIII in Mammalian CellLines.Thrombosis Research., 1999，95: 105 - 115.)PCR擴增 BDD 基因全長 4316bp，受CMV增強子和雞β-actin啟動子的調控，GFP作為細胞株篩選標記，兩個基因表達盒皆位于AAV ITR 之間； 圖1b系本專利技術一較佳實施例中所用質粒pTRUFll的圖譜； 圖1c系本專利技術一較佳實施例中所用質粒PTRP5GDNF的圖譜； 圖1d系本專利技術一較佳實施例中由質粒pTRUFlI和質粒pTRP5GDNF所構建的質粒PTRP5⑶NFGFP的圖譜； 圖2是本專利技術一較佳實施例中rAAV整合質粒pTRP5BDDGFP的酶切鑒定結果，其中，M.1OOOObp ladder ；1.Nsi I 酶切，得到 11059bp 片段；2.Sal I 酶切，得到 1030bp+10029bp片段。圖3a和圖3b分別是本專利技術一較佳實施例中以流式細胞分析對照細胞293與整合細胞株293-BDD GFP基因表達的圖譜，其中AAV Rep蛋白介導ITR之間的BDD基因和GFP基因整合至293細胞基因組，結果顯示98%細胞為GFP陽性細胞； 圖4是分別由FVIII基因及B區缺失的FVIII基因所編碼氨基酸序列的對照結構示意圖。具體實施例方式本專利技術提供了一種AAV定點整合構建表達FVIII的人293細胞株及其構建方法，以及利用該人細胞株表達有活性的重組FVIII的方法。進一步的講,本專利技術是利用rAAV整合質粒與表達整合必需的AAV Rep蛋白的質粒共轉染HEK 293細胞，經過篩選獲得穩定表達FVIII的293細胞株，一方面避免了重組病毒構建及純化過程，更簡單易于操作；另一方面無重組病毒基因組的分子量限制，具有更廣泛的應用性。以下結合一較佳實施例及相應附圖對本專利技術的技術方案作進一步的說明。本實施例可包括如下步驟: 一、擴增BDD基因，構建rAAV整合質粒pTRP5BDDGFP。此質粒是在張春構建的rAAV質粒pTRP5⑶NFGFP基礎上改造而成，將pTRP5⑶NFGFP質粒中⑶NF基因替換為BDD基因。其中，所述BDD基因系B區缺失的FVIII基因(BDD-FVIII)，其全長4316 bp，編碼1438個氨基酸，其相應序列請參見SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2，而其結構請參考圖4。一般來說，成熟FVIII蛋白包含3個區，其結構為A1-A2-B-A3-C1-C2。雖然B區的功能尚未確定，但很多研究表明B區缺失對FVIII (BDD-FVIII)的促凝血和輔因子活性沒有影響；另外，研究表明 ，B區缺失能夠將mRNA水平提高17倍之多，也因此伴有翻譯產物的增加。在本專利技術中，通過選擇BDD-FVIII，可以獲得高表達量的FVIII蛋白。又，前述pTRP5BDDGFP的構建過程包括: 首先，以 BamHI 和 PstI 從 pTRUFll (請參閱圖1b 以及 Characterization of aBipartite rAAV Vector for Site Specific Integration, Hum Gene Ther., 2007,18:787-797.)中切出GFP序列，以及，用BamHI和PstI將neoR從pTRP5⑶NF (參閱圖1c)中切除； 而后，將GFP和pTRP5⑶NF連接得到pTRP5⑶NFGFP (參閱圖1d)； 最后，用Nhe\和AfeiI將⑶NF序列從pTRP5⑶NFGF本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種表達重組人凝血因子的整合質粒，其特征在于，包括：rAAV質粒骨架，以及，整合于所述rAAV質粒骨架中的B區缺失的FVIII基因。

【技術特征摘要】
1.一種表達重組人凝血因子的整合質粒，其特征在于，包括: rAAV質粒骨架，以及， 整合于所述rAAV質粒骨架中的B區缺失的FVIII基因。2.根據權利要求1所述的表達重組人凝血因子的整合質粒，其特征在于，所述B區缺失的FVIII基因連接于所述rAAV質粒骨架內的兩個ITR元件之間。3.根據權利要求2所述的表達重組人凝血因子的整合質粒，其特征在于，所述整合質粒中還包含用作后續細胞株的篩選標記的GFP基因和/或用以提高整合效率的AAV p5啟動子。4.根據權利要求1-3中任一項所述的表達重組人凝血因子的整合質粒，其特征在于，所述rAAV質粒骨架包括rAAV質粒pTRP5⑶NFGFP經MeI和AfeiI雙酶切去除⑶NF基因后所形成的rAAV質粒骨架。5.一種表達重組人凝血因子的整合質粒的構建方法,其特征在于,包括: 提供rAAV質粒骨架， 并將B區缺失的FVIII基因連接至rAAV質粒骨架中，獲得目標產物。6.根據權利要求5所述的表達重組人凝血因子的整合質粒的構建方法，其特征在于，包括:將B區缺失的FVI...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉曉玫，張春，
申請(專利權)人：中國科學院蘇州生物醫學院工程技術研究所，
類型：發明
國別省市：