一種分離培養內皮克隆形成細胞的方法技術

本發明專利技術涉及一種分離培養內皮克隆形成細胞的方法，具體涉及一種從臍帶中分離得到內皮克隆形成細胞的方法，其包括以下步驟：(1)用消化酶消化臍靜脈血管內膜；(2)沖洗消化后的臍靜脈，收集沖洗液；(3)取沖洗液進行細胞培養，得到內皮克隆形成細胞。本發明專利技術分離得到的臍帶源內皮克隆形成細胞，其細胞形態、細胞周期、免疫表型、成管能力和吞噬能力等符合內皮祖細胞生物學特征，證明了臍帶可以作為內皮祖細胞的新來源，為實驗研究和臨床應用提供了保障。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，具體涉及一種從臍帶中分離培養內皮克隆形成細胞的方法。
技術介紹
內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，亦是具有向成熟血管內皮細胞分化能力的祖細胞。許多研究表明EPCs參與胚胎血管和出生后血管發生過程，具有新生血管、修復血管損傷、分泌多種促進新生血管生長因子的作用，在靶向治療缺血性疾病、炎癥性疾病、惡性腫瘤、防止血管再狹窄、血管創傷愈合、促進造血恢復等過程中有著重要臨床應用前景。目前EPCs主要來源于外周血、骨髓和臍帶血，其獲得主要存在以下問題:循環血中的EPCs數目非常低，骨髓取材不便，臍帶血取材及操作困難等。內皮祖細胞分離培養的難度和數量的稀少成為未來臨床應用的一個瓶頸，因此，如何有效獲得EPCs成了實驗研究和臨床應用急需解決的難題，從新的來源尋找EPCs，以克服骨髓等來源的不足成為必要。EPCs有早期EPCs及晚期EPCs兩種亞型，晚期EPCs又稱內皮克隆形成細胞(endothelial colony forming cells, ECFCs),或內皮外向生長細胞,而ECFCs作為內皮祖細胞的一種亞群，具有較高的增殖能力和較強的成血管活性。研究證實ECFCs更適用于心血管疾病等的治療，因此，獲得ECFCs對內皮祖細胞實驗研究和臨床應用非常關鍵。臍帶由羊膜、華氏膠、兩個臍動脈和兩個臍靜脈組成。2005年Ingram和2006年Cherqui兩位學者證實血管壁內存在EPCs。臍帶來源廣泛，取材容易，對供者無不利影響，無道德倫理問題的限制，如果能夠從臍帶中獲得EPCs，將會成為骨髓等來源EPCs的理想替代來源。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種臍帶來源的ECFCs的制備方法，為ECFCs的獲得提供一種具有很大優越性的新來源。本專利技術的一個方面涉及一種從臍帶中分離培養內皮克隆形成細胞的方法，其包括以下步驟:(I)用消化酶消化離體臍帶的臍靜脈血管內膜；(2)沖洗消化后的臍靜脈，收集沖洗液；(3)取沖洗液進行細胞培養，得到內皮克隆形成細胞。在本專利技術中，所述臍帶來源于人或哺乳動物；在本專利技術的一個實施方案中，所述臍帶來源于人。在本專利技術中，所述消化酶可以為任何能夠消化血管內膜的酶，例如可為膠原酶、透明質酸酶或脫氧核糖核酸酶I型；在本專利技術的一個實施方案中，所述消化酶為膠原酶。在本專利技術的一個具體實施方案中， 所述消化酶為II型膠原酶。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，其中所述用消化酶消化臍靜脈血管內膜前還包括沖洗臍帶外周及臍靜脈腔內殘留血液的步驟。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，其中所述用消化酶消化臍靜脈血管內膜的方法為將消化酶注入臍靜脈腔內；任選地，在將消化酶注入臍靜脈腔內之前還包括結扎臍靜脈一端的步驟。在本專利技術的一個實施方案中，將消化酶注入臍靜脈內后，將臍帶放入一定的緩沖液中以維持細胞的活性狀態。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，所述用消化酶消化的條件根據不同的消化酶確定。在本專利技術的一個實施方案中，所述消化酶為膠原酶，其反應條件為37°C溫育。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，其中所述取沖洗液進行細胞培養之前還包括將沖洗液進行濃縮的步驟；所述濃縮的方法例如為先離心，然后棄上清。在本專利技術中，所述濃縮是指收集沖洗液中細胞的過程，例如可以采用離心后棄上清或靜止后棄上清方法進行濃縮；在本專利技術的一個實施方案中，通過離心、棄上清的方式收集細胞。在本專利技術的實施方案中，所述離心的條件為收集細胞的離心條件，例如為1000-2000rpm,離心10_20min ;在本專利技術的一個具體實施方案中，為1500rpm, IOmin ;離心溫度一般為4°C。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，其中所述膠原酶的濃度為0.05-0.2%重量體積比，例如為0.075-0.15%重量體積比；在本專利技術的一個實施方案中，所述濃度為0.1 %重量體積比。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，其中所述的用消化酶消化的時間為30-120min，例如為45_90min，例如為60_80min ;在本專利技術的一個實施方案中，為60min。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，其中所述細胞培養的培養基為適合內皮克隆形成細胞生長的細胞培養基，例如可以為含VEGF及bFGF的M199培養基或含添加多種生長因子的EGM-2培養基或DF-12培養基；在本專利技術的一個實施方案中，為EGM-2培養基。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，在細胞培養基中可以添加5-20%體積胎牛血清，例如為7.5% -15%體積胎牛血清，例如為9% -12%體積胎牛血清；在本專利技術的一個實施方案中，添加了 10%胎牛血清。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，其中步驟(3)中所述的細胞培養是指將細胞按I 2 X IOVcm2接種于培養瓶中進行培養；任選地，3-5天后換液，棄去非貼壁細胞，以后每3-4天半量換液。根據本專利技術第一方面任一項所述的方法，在所述進行細胞培養后，得到的是原代內皮克隆形成細胞，可以通過傳代，獲得傳代后的內皮克隆形成細胞。所述傳代方法為本領域常用的貼壁細胞的傳代方法，例如可以用胰酶消化細胞，然后按照一定比例傳入新的培養瓶中；所述胰酶的濃度例如可以為0.125%-0.25%，所述一定比例可以為1:2-1:4;在本專利技術的一個實施方案中，所述胰酶的濃度為0.25%，所述一定的比例為1: 3。在本專利技術的一個實施方案中，待細胞達80%以上融合時再進行消化傳代。本專利技術的第二方面涉及根據本專利技術第一方面任一項所述方法獲得的內皮克 隆形 成細胞。根據本專利技術第二方面任一項所述的內皮克隆形成細胞，其表達⑶34、⑶73、⑶90、CD105、CD31 和 VEGFR2，不表達 CD45、CD31 和 HLA-DR。根據本專利技術第二方面任一項所述的內皮克隆形成細胞，其表達vWF。本專利技術還涉及臍帶在制備內皮克隆形成細胞中的用途。本專利技術還涉及血管內膜消化酶在制備內皮克隆形成細胞中的用途。 在本專利技術中，按照本專利技術制備方法獲得的內皮克隆形成細胞命名為臍帶源ECFCs。在本專利技術中，所述臍帶可以來源于人或哺乳動物；臍帶是連接胚胎和胎盤之間的索狀結構，外被羊膜，內含臍靜脈、臍動脈和體蒂分化的粘液性結締組織即華通氏膠(Wharton jelly)。在本專利技術中，所述臍帶源ECFCs來源于臍靜脈，因此當臍靜脈從所述臍帶剝離時，所述臍帶也可以指臍靜脈。在本專利技術中，所述血管內膜是指臍靜脈內皮和內皮下層。在本專利技術中，所述消化酶是指能夠消化血管內膜的酶。在本專利技術中，所述消化血管內膜是指通過消化酶的作用分離血管內皮細胞的過程。在本專利技術中，所述膠原酶可以為II型膠原酶或I型膠原酶。在本專利技術中，所述內皮克隆形成細胞是指具有高增殖潛能和成血管能力的一類內皮祖細胞，其形態呈鋪路石樣，具有細胞克隆形成能力，增殖能力強，能夠連續傳代，細胞周期具有干細胞特點，免疫表型為表達⑶34、VEGFR2、⑶73、⑶90、⑶105，同時表達⑶31及vWF成熟內皮細胞標志，不表達HLA-DR，具有和內皮細胞吞噬及成血管能力一樣的功能。附圖說明圖1為臍帶源ECFCs的細胞形態；圖2為臍帶源ECFCs的細胞生長曲線；圖3為臍帶源ECFCs的細胞周期分析；圖4為臍帶源ECFCs的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種從臍帶中分離培養內皮克隆形成細胞的方法，其包括以下步驟：(1)用消化酶消化離體臍帶的臍靜脈血管內膜；(2)沖洗消化后的臍靜脈，收集沖洗液；(3)取沖洗液進行細胞培養，得到內皮克隆形成細胞。

【技術特征摘要】
1.一種從臍帶中分離培養內皮克隆形成細胞的方法，其包括以下步驟: (1)用消化酶消化離體臍帶的臍靜脈血管內膜； (2)沖洗消化后的臍靜脈，收集沖洗液； (3)取沖洗液進行細胞培養，得到內皮克隆形成細胞。2.權利要求1的方法，其中所述消化酶為膠原酶、透明質酸酶或脫氧核糖核酸酶I型。3.權利要求1的方法，其中所述用消化酶消化臍靜脈血管內膜前還包括沖洗臍帶外周及臍靜脈腔內殘留血液的步驟。4.權利要求1的方法，其中所述用消化酶消化臍靜脈血管內膜的方法為將消化酶注入臍靜脈腔內；任選地，在將消化酶注入臍靜脈腔內之前還包括結扎臍靜脈一端的步驟。5.權利要求1的方法，其中所述取沖洗液進行細胞培養之前還包括將沖洗液進行濃縮的步驟；所述濃縮的方法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳虎，張顥，張斌，扈江偉，湯永永，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院附屬醫院，
類型：發明
國別省市：