一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及干細(xì)胞及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。鏈接粘附分子JAM1（NM_016946）是一個(gè)跨膜分子，屬于免疫球蛋白超家族。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，是用鏈接粘附分子JAM1基因修飾和基因干擾表皮細(xì)胞；本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種鏈接粘附分子JAM1基因低表達(dá)的表皮細(xì)胞即JAM1kd-EC，并檢測(cè)了該表皮細(xì)胞的增殖能力及表皮細(xì)胞特性、生物安全性等。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還進(jìn)一步提供上述的促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法和JAM1kd-EC在創(chuàng)面修復(fù)或制備皮膚移植物中的應(yīng)用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及干細(xì)胞及基因工程
，具體涉及一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，及其將該方法應(yīng)用于制備皮膚移植物。
技術(shù)介紹
細(xì)胞具有一定的壽命，細(xì)胞的分裂能力也是有一定限度的，隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，細(xì)胞增殖能力逐漸減弱，最終停止增殖。這也是細(xì)胞從干細(xì)胞經(jīng)過(guò)短暫擴(kuò)增細(xì)胞到終末分化細(xì)胞的過(guò)程。此過(guò)程受很多因素影響，有些因素可以減緩甚至扭轉(zhuǎn)這一進(jìn)程，使細(xì)胞重新獲得分化、增殖能力。目前，使細(xì)胞重新獲得分化和增殖能力的策略有核移植(WilmutI, SchniekeAEj McWhir Jj Kind AJj CampbelI KH..Viable offspring derived from fetaland adult mammalian cells.Nature.1997 Feb 27;385 (6619):810-3.)、雞尾酒基因修飾法(Takahashi K，Yamanaka S.1nduction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factorsCell.2006 Aug 25; 126 (4):663-76.)、細(xì)胞裂解液(Taranger CKj Noer A，S0rensenAL，Hakelien AM， Boquest AC，Collas P.1nduction of dedifferentiation, genomewidetranscriptional programming,and epigenetic reprogramming by extracts ofcarcinoma and embryonic stem cells.Mol Biol Cell.2005Dec;16 (12):5719-35.)、端粒酶轉(zhuǎn)染 Comandini A, Naro C，Adamo R，Molecular mechanisms involved in HIV-1-Tatmediated inhibition of telomerase activity in human CD4 (+)T lymphocytes.Mol Immunol.2012 Dec 31; 54 (2): 181-192.)、生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)染(Hu ZX，Geng JMj LiangDM，Luo M，Li ML.Hepatocyte growth factor protects human embryonic stem cellderived-neural progenitors from hydrogen peroxide-1nduced apoptosis.Eur JPharmacol.20100ct25;645(l-3):23-31.)等。這些方法雖然可以讓成體細(xì)胞恢復(fù)增殖能力，但存在致瘤性、細(xì)胞毒性及細(xì) 胞基因型發(fā)生改變等問(wèn)題。組織工程對(duì)所需種子細(xì)胞的最基本要求就是擴(kuò)增快，效率高。如何在保持原有細(xì)胞特性的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)種子細(xì)胞如表皮細(xì)胞的快速、高效擴(kuò)增已經(jīng)成為組織工程急需解決的重點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)的研究表明慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類(lèi)型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因修飾與治療的效果。在美國(guó)已經(jīng)開(kāi)展了慢病毒介導(dǎo)的基因治療的臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景(Dong A, Rivella S，Breda L.Gene therapy for hemoglobinopathies:progress andchallenge.Transl Res.2013 Jan 18.pi1:S1931-5244(12)00447-1.)。鏈接粘附分子JAMl (GENBANK No:ΝΜ_016946)是一個(gè)跨膜分子，屬于免疫球蛋白超家族。JAMl可以在同源二聚化之后形成多蛋白的大的復(fù)合體，這種復(fù)合體介導(dǎo)細(xì)胞由外到內(nèi)的信號(hào)傳遞。此外，JAMl在細(xì)胞增殖、遷移，器官發(fā)育等方面也有重要作用(參見(jiàn)文獻(xiàn):(I)Nava P，Capaldo CT,Koch Sj et.al.JAM-A regulates epithelial proliferationthrough Akt/β -catenin signalling.EMBO Rep.201IApr;12(4):314-20.； (2)SeversonEA，Lee WY, Capaldo C T，Nusrat A，Parkos CA.Junctional adhesion molecule Ainteracts with Afadin and PDZ-GEF2 to activate RaplAj regulate betalintegrinlevels, and enhance cell migration.Molecular Biology of the Cell Vol.20, 1916 -1925.)基因修飾可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。目前較為安全的基因修飾方法是慢病毒感染。慢病毒基因載體是由I型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒載體，作為一種高效的基因轉(zhuǎn)染載體應(yīng)用越來(lái)越廣泛，經(jīng)多次修飾改造其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和安全性都得到了保證。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)JAMl基因修飾表皮細(xì)胞，以促進(jìn)其快速增殖的研究及應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，本專(zhuān)利技術(shù)的另一目的在于提供該方法在制備皮膚移植物中的應(yīng)用。申請(qǐng)人:基于JAMl可調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖等實(shí)驗(yàn)依據(jù)，構(gòu)建含目的基因JAMl的慢病毒過(guò)表達(dá)載體和JAMl特定干擾序列的慢病毒干擾載體，將其轉(zhuǎn)染表皮細(xì)胞，以便用表達(dá)的外源性JAMl啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，獲得JAMl高表達(dá)和低表達(dá)的表皮細(xì)胞，稱(chēng)之為JAM1°V-EC和JAMlkd-EC。繪制 生長(zhǎng)曲線法測(cè)量各組細(xì)胞的增殖速度。免疫組化測(cè)量各組細(xì)胞的表皮細(xì)胞特性。裸鼠皮下注射法測(cè)量各組細(xì)胞有無(wú)致瘤性。本專(zhuān)利技術(shù)的主要技術(shù)方案如下:首先是根據(jù)JAMl的基因結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)引物，以人表皮細(xì)胞總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，制備JAMlcDNA，再構(gòu)建重組人peGFP-Nl-JAMl真核表達(dá)載體，為提高轉(zhuǎn)染效率，構(gòu)建慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pGC-FU-JAMl-GFP，將慢病毒感染人表皮細(xì)胞。設(shè)計(jì)并合成引物如下:Pl:CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC (SEQ ID NO:1)P2:ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG (SEQ ID NO:2);以人表皮細(xì)胞總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，制備JAMlcDNA (SEQ ID NO: 3) 其中的慢病毒載體的構(gòu)建方法為常規(guī)方法，可參見(jiàn)工具書(shū)(耿運(yùn)琪主編，慢病毒與泡沫病毒分子生物學(xué)文選，南開(kāi)大學(xué)出版社)。也可以用以下的具體步驟:(I)設(shè)計(jì)并合成引物如下:JAMl-Age 1-F 如 SEQ ID N0:4 所示，JAMl-Age 1-R 如 SEQ ID N0:5 所示，Ub1-F 如 SEQ ID NO:6 所示，EGFP-N-R 如序列 本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的方法，是用鏈接粘附分子JAM1基因修飾和基因干擾表皮細(xì)胞，該方法包括：A、構(gòu)建JAM1RNA干擾的慢病毒；B、將步驟A獲得的慢病毒去感染表皮干細(xì)胞，獲得JAM1低表達(dá)的表皮細(xì)胞。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉厚奇，仵敏娟，周童，郭曉燦，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：