本發明專利技術公開了大豆小RNA基因gma-miR169d，它是利用Solexa測序技術獲得了的microRNAs，分析結果表明，豆小RNA基因gma-miR169d與大豆干旱調控相關，將含有gma-miR169d的成熟基因片段連接到載體上，并轉入擬南芥，通過抑制擬南芥細胞內的靶基因的表達來進一步提高擬南芥對干旱的耐受能力。解決了轉耐干旱基因操作涉及基因序列過長而遭遇轉化困難等問題，該類干旱誘導的miRcroNA為小分子表達調控基因，且為大豆內源性microRNA，不編碼產生蛋白。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬植物基因工程
，具體涉及一個大豆抗干旱大豆HiiCT0RNA基因gma-miR169d,及其在抗旱調控中的應用。
技術介紹
植物在生長過程中受到生物和非生物類的逆境脅迫，其中干旱是植物正常生長重要限制性因素之一。干旱會引起植物原生質體脫水，改變細胞膜的結構與透性，最終導致農作物產量降低。植物在干旱的過程中，通過關鍵基因的調控抵御或防衛干旱帶來的不利影響。利用抗性基因資源改良植物的抗旱性，是提高農作物產量的有效方法。植物對環境變化作出應激反應是基因水平調控和表觀遺傳調控的共同結果。microRNA分子作為一類非編碼小分子，直接參與植物的生長、發育及對脅迫環境的耐受性。成熟的miRNA通過與祀mRNA的特定位點結合,引發mRNA的降解或抑制翻譯來介導作用革巴基因的轉錄后沉默。microRNA作為細胞逆境應答的激活因子出現，特異的回應逆境脅迫。有研究指出玉米在鹽脅迫下，高粱在干旱脅迫下均涉及大量microRNAs表達水平改變。大豆受干旱脅迫的microRNA基因調控研究亦是增強或改善大豆抗逆的焦點。MiRNA169是對干旱產生應答的一個重要小RNA，在大豆中共有21個家族成員。根據研究發現，在干旱處理條件下不同植物心TfVSP的表達具有差異。在水稻中，干旱處理下miR169g的表達下調，miR169gmiR169n是一個小RNA簇以串聯形式存在，兩者距離是3707bp。hniR169n(o)基因的上游有ABRE脫落酸響應元件說明則TtV你可能受到ABA的調控。在干旱滲透脅迫下則7 故汝.通過脫水響應元件DRE被誘導。NF-Y是一個可以和CCAAT box結合的一類蛋白復合體，是進化保守的轉錄因子。NF-Y核轉錄因子包括三個亞基，NF-YA，NF-YB，NF-YC，編碼亞基的基因包含一個進化保守區域，負責和DNA結合。研究表明，番茄在受到干旱脅迫時Sly-miR169表達上調，所預測的三個靶基因(NF-YA1，NF-YA2,NF-YA3)的表達量明顯下降，超表達幻你c番茄植株的氣孔開放數量減少，降低了蒸騰作用葉片的水分損失率，抗干旱能力明顯增強。專利技術目的 本專利技術的目的是提供一種大豆干旱調控相關的miciORNAs，大豆小RNA基因gma_miR169d。大豆小RNA基Mgma-miR169d,它包括堿基序列如序列表SEQ ID N0.1和/或2所不的基因。大豆小RNA基因例anTtV你￡/，它的堿基序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 一種重組載體質粒，它是在RNA表達載體中插入大豆小RNA基因gmaidR169d ； 所述的表達載體為pBASTA-RD，它是用多克隆位點接頭替換pEGAD載體中的EGFP(Ala)10基因序列構建而成 ； 所述的表達載體為P35S-N0S，它是用化學合成的MCS序列替換HBT-sGFP (S65T) -NOS載體 PST I (3978)和 Hind 111(3025)酶切位點間的 C4ppdklZm_sGFP(S65T)序列構建而成。大豆小RNA基因gma-miR169d在生產耐旱轉基因植物中的應用。本專利技術提供了大豆小RNA基因gma_miR169d,它是利用Solexa測序技術獲得了的microRNAs,分析結果表明，大豆小RNA基因gma-miR169d與大豆干旱調控相關，將含有gma-miR169d的成熟基因片段連接到載體上，并轉入擬南芥，通過抑制擬南芥細胞內的靶基因的表達來進一步提高擬南芥對干旱的耐受能力。解決了轉耐干旱基因操作涉及基因序列過長而遭遇轉化困難等問題，該類干旱誘導的miRCToNA為小分子表達調控基因，且為大豆內源性microRNA,不編碼產生蛋白。附圖說明圖1 HBT-sGFP (S65T)-NOS 載體圖譜； 圖2 p35S-N0S載體圖譜； 圖3大豆原生質共轉化基因的表達水平分析圖；A組轉化p35S-N0S質粒；B 組轉化 p35S-N0S-169d 質粒；C 組轉化 HBT-sGFP (S65T)-NOS 質粒；D 組轉化 HBT-sGFP (S65T)-N0S-NF-YA10 質粒；E 組共轉化 p35S_N0S 和HBT-sGFP(S65T)-NOS ；F 組共轉化 p35S-N0S_169d 和 HBT-sGFP(S65T)-NOS ;G 組共轉化 P35S-N0S 和 HBT-sGFP (S65T)-N0S-NF-YA10 ；H 組共轉化 p35S-N0S_169d 和HBT-sGFP(S65T)-NOS-NF-YAIO0圖4 pBASTA-RD 載體圖譜； 圖5野生型和轉基因擬南芥的發芽率對比； 圖6野生型和轉基因擬南 芥的葉片及根系生長狀況。具體實施例方式本專利技術的前期研究結果顯示采用大豆品種吉育72水培幼苗作為實驗材料，在干旱誘導條件下，gma-miR169d表達水平增高。實施例1:gma_miR169d前體基因的克隆 以吉育72大S.品種(吉林省長春市新城大街2888號，郵編130118,吉林農業大學，農學院，王振民老師提供)為實驗對象，進行水培。大豆種子使用滅菌蒸餾水清洗3次后，IX Hogland營養液水培，每2天更換一次培養液。設置對照組和處理組。待大豆培養至第2對復葉萌發后，處理組大豆使用2% PEG8000脅迫處理24h后，液氮冷凍材料，對照樣組和PEG8000處理組提取總RNA。將大豆葉片使用液氮研磨成粉末后，將100 mg葉片干粉用小藥匙轉移至RNase-free的eppendorf離心管中，并加入I ml RNAiso Plus (購買自Takara),搖勻后室溫靜置5 min,4°C、12000rpm離心5min,將清液轉入新的離心管中，加入200ul氯仿后蓋緊離心管蓋，震蕩30 s，4°C U3000rpm離心5min，取上清，加入400 ul異丙醇，-20° C放置lh，4°C、13000rpm離心15min，沉淀用Iml 70%酒精洗滌2次，沉淀放超凈工作臺上吹干，用20 ul RNase-free水溶解，置于-80°C保存。總RNA反轉錄(BioTekesuper RT Kit購買自北京寶泰克生物技術有限公司)，得到的cDNA作為PCR模板。Gma-miR169d前體基因序列的PCR引物: miR169d Fl AGATTAGTGGATGTGAGCCAAG miR169d Rl TAAGAATAGTAAATAAGAACCPCR反應條件和體系:TaKaRa Ex Taq (5U/ul) 0.25ul ；10X Ex Taq Buffer 5ul ；dNTP Mixture (各2.5mM)4ul ;模板 cDNA 2.5ng ;引物 Fl( 10uM)2ul ;引物 Rl( 10uM)2ul ;滅菌蒸懼水 up to 50ul。95°C 5min ；95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s (30 Cycles) ；72°C 7min。將擴增出的PCR產物連接克隆載體(pEASY-Tl Simple Cloning Kit，購自北京全式金生物技術有限公司)，得載體pEASY-Tl-169d，酶切鑒定后測序(金唯智生物科技本文檔來自技高網...
【技術保護點】
大豆小RNA基因gma?miR169d，它包括堿基序列如序列表SEQ?ID?No.1和/或2所示的基因。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李海燕，董園園，尹海龍，劉偉燦，王法微，陳歡，王南，周穎，周永剛，趙利旦，
申請(專利權)人：吉林農業大學，
類型：發明
國別省市：
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