本發明專利技術公開了一種低溫脂肪酶及其基因，該低溫脂肪酶氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，其基因來源于昆明市屠宰場冷庫的耶爾森氏菌（Yersinia?enterocolitica）KM1，本發明專利技術利用含該酶基因的重組表達載體制備低溫脂肪酶，該表達載體制得的低溫脂肪酶在低溫條件具有良好的活性和穩定性，最適作用溫度為25℃，作用pH值為7.5，可廣泛應用于洗滌劑、生物柴油制備等工業領域。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及酶基因工程和酶工程領域，具體涉及一種低溫脂肪酶Lipl及其基因與應用。
技術介紹
脂肪酶(LipaSe，EC 3.1.1.3)是一類在油-水界面上催化天然油脂(甘油三脂)降解為甘油和游離脂肪酸的酶，廣泛存在于植物、動物和微生物中。因為其具有不需要輔酶就能催化正逆反應的優點，近些年來，脂肪酶作為類脂化合物合成分解和酯交換的催化劑，已廣泛應用于油脂水解、食品風味和香味的改進、皮革絹紡脫脂、生物柴油制備及添加于洗滌劑中以提聞去污能力等。目前工業上應用的脂肪酶大多是中溫和高溫脂肪酶，它們大多由微生物產生，且基本上為胞外酶，產酶的最適溫度多在30°C以上，而酶的最適反應溫度一般在40°C左右或更高，在0°C附近普遍喪失活性。目前研究的低溫脂肪酶普遍由低溫微生物分泌產生，酶的最適反應溫度一般均低于40°C，而在0°C仍具高酶活。由于它們普遍具有低溫下酶活力高、抗有機溶劑等特點，因而成為了近年來酶學研究及工業應用探索的一個熱點。生物柴油是由動植物油脂與一些短鏈醇發生轉酯反應生成的脂肪酸酯類物質，是一種新型的無污染的可再生能源。生物柴油的生產方法有化學法和生物法，化學法使用的催化劑多為酸堿催化劑，容易造成二次污染；而生物法利用酶作為催化劑，具有反應條件溫和、對環境友好、反應過程簡單易控等優點；因此酶法生產生物柴油的研究己受到廣泛關注。由于酶法合成生物柴油一般是在有機溶劑中進行，考慮到反應底物和產物的易揮發性，在低溫條件下更加有利于酶反應的進行，并且也可同時改善生物柴油的特性(Juan等，EP1331260，2003 )。在洗滌行業，我 國的洗滌方法是以低溫洗滌為主，近來為了節省能源，歐美國家也出現了洗滌溫度低溫化的趨勢，中溫脂肪酶由于在低溫條件下酶活差，效率低，達不到最佳應用效果，只有增加用量才能達到最佳應用效果。因此理想的洗滌劑用脂肪酶是在低溫下也能充分發揮作用的脂肪酶。低溫脂肪酶的最適酶活溫度一般在40°C以下，它具有最適酶活溫度低，在低溫下具有更高的催化效率等特點。因而在洗滌劑、生物柴油制備等工業上應用有著中溫脂肪酶無法取代的優越性。脂肪酶己從多種不同的微生物中分離，已有一些來自細菌的低溫脂肪酶，如嗜冷iPsychrobacter iimobilis產生的脂肪酶，最適溫度為55°C;假單胞菌sp.Bll產生的脂肪酶最適溫度為為45°C ;但目前還未見最適溫度低于30°C低溫脂肪酶的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的旨在提供一種新型低溫脂肪酶Lipl，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本專利技術中低溫脂肪酶是具有SEQ ID NO:2氨基酸殘基序列的蛋白質，或與SEQ IDN0:2的氨基酸殘基序列具有至少80%的同源性且具有與SEQ ID NO:2蛋白質相同活性的由SEQ ID N0.2衍生的蛋白質，由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:2蛋白相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質。本專利技術另一目的是提供一種編碼上述低溫脂肪酶Lipl的基因。本專利技術中所述低溫脂肪酶Lipl的基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或與SEQID N0:1的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列，且該序列編碼相同功能蛋白質的DNA序列，或編碼SEQ ID NO:2所示氨基酸序列蛋白質的多核苷酸。本專利技術另一目的是提供含有低溫脂肪酶Lipl基因的重組表達載體pET28a_7i/77，將表達載體pET28a-7i/77導入大腸桿菌細胞內，通過誘導劑IPTG的誘導，完成低溫脂肪酶Lipl的表達，從而為利用該表達載體制備低溫脂肪酶Lipl和其工業生產奠定理論基礎。本專利技術另一目的是將低溫脂肪酶Lipl應用在中長鏈的脂肪酸酯催化中，本專利技術采用橄欖油作為底物驗證脂肪酶的催化活性。為了實現本專利技術的上述目的，本發現提供了下述技術方案: 1、低溫脂肪酶Lipl基因的獲得 (1)以耶爾森氏菌(/ersifliaenterocolitica)KMl (本實驗室分離自昆明市肉聯廠冷庫，菌株已經于2008年8月26日在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”保藏，保藏號為=CGMCC N0.2637)的基因組DNA為模板利用以下引物進行PCR擴增，引物序列如下:lipl Fl: 5，-GGGTTTCATATGATGTCTACAMTTCMCTTTGAAATATCCAGTCGTATTAGTT-Silipl Rl:5’ -CCGGAATTCTTACAGGCCTTTTGATTT-3’ 在上下游引物的5’端和3’分別加入內切酶和EcoRi酶切位點及保護堿基，提取耶爾森氏菌(enterocolitica)m\的基因組DNA，并以基因組DNA為模板利用上述引物PCR擴增得到低溫脂肪酶Lipl的基因707 ； (2)膠回收目的基因707。2, Iipl基因的TA克隆及構建大腸桿菌表達載體pET28a-7i/77 使用PMD18-T載體進行TA克隆，于16°C過夜連接，轉化感受態細胞大腸桿菌DH5a，用內切酶和EcoRi酶進行雙酶切驗證和PCR驗證后，陽性克隆送去測序公司進行測序；使用限制性內切酶和EcoR\酶對pET28a和測序正確pMD18_7i/77載體進行雙酶切，分別獲得5’和3’末端分別帶有內切酶和EcoRl酶切位點的Iipl基因和pET28a載體大片段，瓊脂糖凝膠電泳后分別進行回收，回收產物在16°C連接16h，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5ci，PCR驗證，陽性克隆送樣測序，進行測序比對分析，獲得大腸桿菌表達載體pET28a-_/i/ /。Uipl基因的表達 制備大腸桿菌BL21的感受態細胞，使用化學轉化法將表達載體轉化進大腸桿菌細胞中，通過PCR驗證成功得到轉化菌株，挑取單克隆接至Kan-LB液體培養基振蕩培養獲得種子液。按照1%接種量轉接菌液至Kan-LB液體培養基，37°C振蕩培養2h后中加入IPTG誘導基因表達，使用LB-羅丹明B培養基驗證脂肪酶活性。4、蛋白濃度標準曲線的制作及低溫脂肪酶蛋白濃度的測定 利用BCA蛋白濃度測定試劑盒中的蛋白標準品BSA和待測低溫脂肪酶樣品，在酶標儀上測定蛋白標準品和待測樣品在562nm (或540_595nm波長)波長下的吸光值，根據蛋白標準品濃度和吸光值，制作蛋白濃度標準曲線，從標準曲線和樣品稀釋倍數計算低溫脂肪酶樣品的蛋白濃度。5、利用Amersham公司的AKTA FPLC系統純化低溫脂肪酶 利用Amersham公司的AKTA FPLC系統純化低溫脂肪酶，獲得純度較高的低溫脂肪酶進行后續脂肪酶酶學性質測定實驗。6、采用橄欖油作為底物，驗證低溫脂肪酶Lipl在中長鏈的脂肪酸酯催化中的應用 本專利技術中克隆的脂肪酶·基因是首次從耶爾森氏菌enterocolitica)KMl中克隆得到的，并在大腸桿菌中(如BL21)表達，得到的基因工程菌株相對于野生型菌株可以顯著提高低溫脂肪酶的產量，為提高低溫脂肪酶的工業產量奠定了分子基礎。本專利技術對低溫脂肪酶理化性質進行研究，提供了該低溫脂肪酶在工業生產中的多種用途，該基因表達產物一低溫脂肪酶Lipl相對其他中溫脂肪酶具有最本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種低溫脂肪酶Lip1，其特征在于：所述低溫脂肪酶Lip1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：魏云林，王寶強，季秀玲，林連兵，張琦，
申請(專利權)人：昆明理工大學，
類型：發明
國別省市：
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