由全保護核苷磷酰胺中間體通過酸催化合成核苷三磷酸和核苷二磷酸的方法技術

一種由全保護核苷磷酰胺中間體通過酸催化合成核苷三磷酸和核苷二磷酸的方法，以芐氧羰基保護核苷為原料，與芐氧基二異丙基氨基亞磷酰氯在堿性條件下生成亞磷酰胺中間體粗品；再經弱酸催化水解得到核苷-氫亞磷酸二酯中間體粗品；核苷-氫亞磷酸二酯中間體粗品，與烷基胺進行氧化偶聯，柱層析得到全保護核苷磷酰胺前體；再在N,N-二甲基甲酰胺溶液中經催化、氫化脫除全部保護基，之后過濾除去鈀碳；與焦磷酸或單磷酸烷基銨鹽在弱酸性催化劑存在的條件下反應得到核苷二磷酸和核苷三磷酸產物。本發明專利技術大幅度地提高了焦磷酸和單磷酸試劑與核苷磷酰胺中間體的反應速度和產率，為核苷5′-三磷酸和核苷5′-二磷酸的化學合成建立了一種高效和通用的新方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于天然產物類生化試劑的化學制備
，涉及一種。
技術介紹
核苷三磷酸是基因復制、轉錄、轉譯的物質基礎，在分子生物學和醫藥研究中，脫氧核苷三磷酸有著廣泛的應用。聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)技術在體外利用DNA聚合酶擴增特定的DNA片斷，被用于基因圖譜的建立、親子鑒定、基因克隆和疾病檢測等。四種天然脫氧核苷三磷酸正是這項技術不可或缺的反應底物。目前，四種天然脫氧核苷三磷酸主要用于生產PCR實驗試劑盒。而且隨著PCR技術應用的拓展，其需求還在迅速遞增。有關核苷三磷酸化學合成的研究最早可以追溯到上世紀中葉。目前，核苷三磷酸類化合物的化學合成已經建立了如“磷酰胺法”、“一鍋三步法”、“水楊酸亞磷酰氯法”等多種可行的合成路線。雖然已知的各種方法有其各自適合的核苷底物類型，但是普遍合成產率不高，目前為止還沒有任何一種方法可以適用于全部核苷三磷酸的高效合成，從而真正徹底解決核苷三磷酸化學合成的難題。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種通用性強、高效的。本專利技術的 ，包括以下步驟: 全保護核苷磷酰胺中間體的合成方法: 1、以芐氧羰基(Cbz)保護核苷(如圖1中物質1-9)為原料，與芐氧基二異丙基氨基亞磷酰氯(如圖1中物質10)在堿性條件下生成亞磷酰胺中間體粗品，芐氧羰基保護核苷與芐氧基二異丙基氨基亞磷酰氯的摩爾比例為1:1-3 ;縛酸用的有機堿為三甲胺、三乙胺、三正丙胺、三異丙胺、三正丁胺、三異丁胺、三戊胺、三己胺、三辛胺、於甲基嗎啉、甲基環己胺、1,4-二甲基哌嗪、二異丙基乙基胺，1，8-二氮雜二環 -|碳-7-烯中的任意一種；芐氧羰基保護核苷與有機堿的摩爾比例為1:1-5 ;反應溶劑為無水二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、乙醚、乙腈、四氫呋喃、1，4-二氧六環中的任意一種；反應溫度在-50°C至+50°C之間，反應時間在30分鐘至3小時。2、亞磷酰胺中間體粗品再經弱酸催化水解得到核苷-氫亞磷酸二酯中間體粗品，所使用的弱酸性催化劑為M1-四氮唑、4，5- 二氰基咪唑、I, 2，4-三氮唑、4-硝基苯酚、羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑、咪唑鹽酸鹽、甲基咪唑鹽酸鹽、吡啶鹽酸鹽、吡啶對甲苯磺酸鹽、三乙胺鹽酸鹽中的任意一種；反應溶劑為乙腈、四氫呋喃、1，4-二氧六環中的任意一種；反應溫度在_50°C至+50°C之間，反應時間在10分鐘至2小時。3、核苷-氫亞磷酸二酯中間體粗品，最后與烷基胺進行氧化偶聯，柱層析得到全保護核苷磷酰胺前體，所使用的烷基胺為哌啶、4-甲基哌啶、嗎啉、脯氨酸甲酯中的任意一種，與上一步中間體的摩爾比例為1:3-10 ;氧化劑為四氯化碳、六氯乙烷、四溴化碳、溴代琥珀酰亞胺、碘中的任意一種，與上一步中間體的摩爾比例為1:5-30;有機堿為三甲胺、三乙胺、三正丙胺、三異丙胺、三正丁胺、三異丁胺、三戊胺、三己胺、三辛胺、甲基嗎啉、於甲基環己胺、1，4-二甲基哌嗪、二異丙基乙基胺、1，8-二氮雜二環 i^一碳-7-烯、吡啶、2，6-二甲基吡啶中的任意一種，與上一步中間體的摩爾比例為1:2-20 ;反應溶劑為二氯甲烷、1，2- 二氯乙烷、氯仿、乙醚、乙腈、四氫呋喃、1，4- 二氧六環中的任意一種；反應溫度在_50°C至+80°C，反應時間在15分鐘至3小時。核苷二磷酸和核苷三磷酸的酸催化合成方法: 1、全保護核苷磷酰胺(如圖1中物質11-46)在#，#-二甲基甲酰胺溶液中經催化、氫化脫除全部保護基，之后過濾除去鈀碳，其工藝條件是，5%或10%鈀碳與全保護核苷磷酰胺的質量比例為1:10-20，縛酸用的有機堿為三甲胺、三乙胺、三正丙胺、三異丙胺、三正丁胺、三異丁胺、三戊胺、三己胺、三辛胺、於甲基嗎啉、於甲基環己胺、1，4-二甲基哌嗪、二異丙基乙基胺、1，8-二氮雜二環十一碳-7-烯中的任意一種，全保護核苷磷酰胺與有機堿的摩爾比例為1:1_2，氫氣壓力在1-2個大氣壓，反應溶劑為#，#_ 二甲基甲酰胺或二甲基亞砜，反應溫度為0°C至+40°C，反應時間在6至72小時。2、上述核苷磷酰胺前體再與焦磷酸或單磷酸烷基銨鹽在弱酸性催化劑存在的條件下反應得到核苷二磷酸和核苷三磷酸產物，所述焦磷酸鹽為焦磷酸三(四正丁銨)鹽、三(三乙銨)鹽、三(三正辛銨)鹽、二(四正丁銨)鹽、二 (三乙銨)鹽、二(四正辛銨)鹽中的任意一種，其與磷酰胺的質量比例為2-3:1 ;單磷酸鹽為單磷酸二(四正丁銨)鹽、二 (三乙銨)鹽、二 (三正辛銨)鹽、單(四 正丁銨)鹽、單(三乙銨)鹽、單(四正辛銨)鹽中的任意一種，其與磷酰胺的質量比例為2-5:1 ;弱酸性催化劑為4，5- 二氰基咪唑，IH-四氮唑、吡啶鹽酸鹽、批啶對甲苯磺酸鹽、二甲基苯胺鹽酸鹽中的任意一種，與磷酰胺的質量比例為4-10:1 ；反應溫度在0°C至+30°C，反應時間在6至72小時。3、上述步驟的粗產物經過乙醇沉淀,離子交換凝膠色譜(Sephadex A-25)或反相C18 HPLC純化，以及最終的離子交換得到18種高純度核苷二磷酸和核苷三磷酸(如圖1中物質 47-64)。本專利技術的，通過全保護核苷磷酰胺中間體，利用弱酸性催化劑活化五價磷-氮鍵的方法，大幅度地提高了焦磷酸和單磷酸試劑與核苷磷酰胺中間體的反應速度和產率，為核苷5'-三磷酸和核苷5' - 二磷酸的化學合成建立了一種高效和通用的新方法。附圖說明圖1為本專利技術方法的反應步驟示圖。圖2為本專利技術方法的反應步驟示圖。具體實施方式實施例1: N- (O-芐基-O-{2' ,V - 二芐氧羰基)尿苷-5'-)磷酰哌啶(如圖1中物質11)的合成:將2'，3' -二芐氧羰基尿苷(如圖1中物質1，500 mg,0.98 mmol)溶于干燥乙腈(20 ml),在攪拌的條件下加入干燥二異丙基乙基胺(0.43 ml, 2.5 mmol)。將節氧基氯代亞磷酰二異丙胺(如圖1中物質10，534 mg, 1.95 mmol)溶于無水干燥乙腈(10 ml)中，然后緩慢滴加到反應瓶中。滴加完畢，繼續反應45分鐘。減壓濃縮反應液，殘余物再用乙腈(10ml)共沸兩次。向殘余物中加入少量乙酸乙酯，沉淀生成的二異丙基乙基胺鹽酸鹽。過濾除鹽，將濾液濃縮后，得黃色油狀化芐基-^-(2'，3' - 二芐氧羰基)腺苷-5'-亞磷酰二異丙胺中間體粗品。將油狀物溶于乙腈(20 ml)中，加入1"-四氮唑(140 mg, 2 mmol)和水(0.2 ml)，室溫攪拌10分鐘。濃縮反應液，將殘余物溶于乙酸乙酯(50 ml)中，然后依次用2%稀鹽酸(30 ml)和水(30 ml)洗滌。有機相經無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮得油狀核苷芐基氫亞磷酸二酯粗品。將哌啶(146 1,1.47 mmol)溶乙腈(10 ml)中，然后加入甲基嗎啉(0.05 ml)和四氯化碳(0.15 ml)。將尿苷芐基氫亞磷酸二酯粗品溶于乙腈(2 ml)，在冰浴的條件下，緩慢滴入哌啶溶液中。滴加完畢后，繼續反應20分鐘。減壓濃縮，殘余物中加入少量乙酸乙酯，沉淀生成的的於甲基嗎啉鹽酸鹽，過濾除鹽。將濾液濃縮后得到黃色油狀物。硅膠柱層析分離(石油醚:乙酸乙酯=1:2至二氯甲烷:甲醇=50:1)，得到白色泡沫狀固體615 mg，產率:84%。實施例2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種由全保護核苷磷酰胺中間體通過酸催化合成核苷三磷酸和核苷二磷酸的方法，其特征在于：它包括以下步驟：?全保護核苷磷酰胺中間體的合成方法：（a）、以芐氧羰基保護核苷為原料，與芐氧基二異丙基氨基亞磷酰氯在堿性條件下生成亞磷酰胺中間體粗品；（b）、亞磷酰胺中間體粗品再經弱酸催化水解得到核苷?氫亞磷酸二酯中間體粗品；（c）、核苷?氫亞磷酸二酯中間體粗品，最后與烷基胺進行氧化偶聯，柱層析得到全保護核苷磷酰胺前體；核苷二磷酸和核苷三磷酸的酸催化合成方法：（d）、全保護核苷磷酰胺在N,N?二甲基甲酰胺溶液中經催化、氫化脫除全部保護基，之后過濾除去鈀碳；（e）、再與焦磷酸或單磷酸烷基銨鹽在弱酸性催化劑存在的條件下反應得到核苷二磷酸和核苷三磷酸產物；（f）、上述步驟的粗產物經過乙醇沉淀，離子交換凝膠色譜或反相C18?HPLC純化，以及最終的離子交換得到18種高純度核苷二磷酸和核苷三磷酸。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫麒，龔珊珊，孫劍，蒲守智，劉國棟，多樹旺，肖強，
申請(專利權)人：江西科技師范大學，
類型：發明
國別省市：