小分子靶定的蛋白質降解制造技術

本發明專利技術的某些方面涉及通過增強蛋白質的降解而對治療或預防受試者中的疾病有用的化合物、組合物和方法。在其它方面，所述化合物可以是用于研究蛋白質降解的有用研究工具。在其它方面，所述化合物為用于研究蛋白質功能的有用研究工具。在某些實施方案中，降解的蛋白質牽涉于以下疾病或病癥，所述疾病或病癥的病理學至少在某種程度上與蛋白質的過度表達或突變形式蛋白質的表達有關。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】小分子靶定的蛋白質降解相關申請 本申請要求保護2010年6月30日提交的美國臨時專利申請序號61/360，257的優先權的權益，所述申請的內容通過弓丨用結合到本文中。政府支持 本專利技術使用國立衛生研究院授予的獎助金號ROl GM054403和UOl A1075466下的美國政府支持進行。政府在本專利技術中具有一定權利。
技術介紹
雖然存在用于在轉錄水平上操縱蛋白質表達的強大的工具盒，但是用于翻譯后調節的方法很少且大部分依賴于融合蛋白的表達。雖然這類系統可提供對細胞過程的重要的深入理解，但是對融合蛋白表達的需要可為約束性的以及用于治療用途的可能性為零。誘導內源性蛋白質降解的小分子策略顯然會是用于探測蛋白質功能的非常有用的工具以及用于化療的令人興奮的新方法。挑戰為開發可廣泛適用的技術。靶定基因敲除和RNAi為目前選擇用于去除內源性蛋白質的方法。兩種方法均非常有用，但二者均具有嚴重的局限性。最受關注的蛋白質常常為必需的并因此不順從基因敲除。雖然這個問題常常可用調節的基因表達或條件基因靶向(例如四環素或Cre-1oxP系統)來避免，但是這類實驗可能因基因表達缺失和蛋白質耗竭之間的長時間而難以解釋。RNAi亦受誘導時間限制，所述誘導時間可以是很多天。RNAi敲減可能常常不完全或受脫靶效應困擾。重要的是，并非所有生物具有RNAi途徑:其在瘧原蟲中尤其缺乏。更嚴重的是，在此方法可在哺乳動物中和在臨床上具有廣泛應用之前，需要克服在滲透性和遞送方面的主要障礙。如果可經由小分子來利用胞內蛋白質降解機構，則可能避免這些問題。數個實驗室已開發出其中小分子調節蛋白質降解的系統。最常見的策略涉及融合蛋白的表達，所述融合蛋白使靶標與不穩定的“降解決定子”結構域偶聯。所述降解決定子結構域通過配體的存在來穩定；去除配體則誘導降解。例如，已將不穩定的DHFR突變體用于產生溫度敏感性降解決定子，所述降解決定子通過甲氨蝶呤或甲氧芐啶(TMP)來穩定。其它系統使用基于雷帕霉素相互作用蛋白FKBP12和FKBP-雷帕霉素結合蛋白(FRB)的降解決定子。這些結構域在缺少基于雷帕霉素的配體時不穩定；再次在去除配體時誘導降解。在SURF系統中發現了基于雷帕霉素的二聚化的特別巧妙的運用。在這種情況下，雷帕霉素通過使降解決定子從靶蛋白上移除來終止降解。已證明這些系統非常有用，但是受到以下限制:其需要配體的恒定存在以維持蛋白質水平——通過添加小分子來誘導降解的系統會更容易維持。另一種方法利用一對融合蛋白將靶蛋白直接局限至蛋白酶體，一個配偶體在靶蛋白上而另一個配偶體在蛋白酶體亞基上。重要的是，此策略的成功證實蛋白酶體局限化足以誘導降解。已將相似策略用于細菌中的靶蛋白降解。雖然上述系統在不同程度上成功調節轉基因融合蛋白的水平，但不能用于降低內源性蛋白質的水平。已描述了蛋白質水解靶向嵌合分子(PROTAC)。PROTAC含有識別靶蛋白的配體，所述靶蛋白與結合特異性E3遍在蛋白連接酶的配體連接。已報道甲硫氨酸氨肽酶、雄激素受體、雌激素受體和芳烴受體的降解。在大多數情況下，E3連接酶靶向配體為肽，這限制了治療用途。此外，此方法僅在表達靶定的E3連接酶的細胞和生物中起作用。更普遍的是，遍在蛋白途徑極其復雜且甚少理解，這表明這些途徑的受控操作很難。將蛋白質直接靶定至蛋白酶體的小分子策略相對于PROTAC將具有許多優勢。此外，蛋白質必須折疊成其正確的三維構象來實現其生物功能。多肽的天然構象在其一級氨基酸序列內編碼，乃至氨基酸序列中的單突變可損害蛋白質實現其適當構象和/或功能的能力。如果蛋白質未能正確折疊，或無活性，那么生物效應和臨床效應可能是破壞性的。例如，蛋白質聚集和錯折疊為許多人類疾病的主要促成者，所述疾病例如常染色體顯性色素性視網膜炎、阿爾茨海默氏病、α 1-抗胰蛋白酶缺乏、囊性纖維化、腎性尿崩癥和朊病毒介導的感染。在其它蛋白質折疊病癥例如年齡相關的黃斑變性、帕金森病和亨廷頓舞蹈病中，因錯折疊蛋白質的細胞毒性效應而導致病理學。突變(例如錯折疊)蛋白常常通過內質網(ER)質量控制系統來識別并通過蛋白酶體來靶定以降解。除蛋白酶體途徑之外，自噬為用于蛋白質降解的另一個主要的細胞機制。雖然自噬可受多種胞內和胞外應力刺激，所述應力包括氨基酸饑餓、蛋白質聚集和損傷細胞器的蓄積，但自噬似乎在很大程度上為非選擇性過程。與亨廷頓舞蹈病相關的有聚集傾向的聚谷氨酰胺和聚丙氨酸延展蛋白，通過自噬來降解，并且自噬的抑制降低亨廷頓病的蠅模型和小鼠模型中突變型亨廷頓蛋白的毒性。亦已顯示自噬促進在ER中蓄積的蛋白質的清除。用于增加突變蛋白降解的方法可能增強這類蛋白質的清除，從而降低或消除其細胞毒性效應。參見例如標題為“Materials and Methods for Enhanced Degradation ofMutant Proteins Associate with Human Disease (用于增強與人類疾病相關的突變蛋白降解的材料和方法)”的美國專利申請號2010/0087474 Al，其通過引用以其整體結合到本文中。誘導突變蛋白降解的小分子策略亦會是有用的工具。專利技術概述 本專利技術的某些方面涉及這樣的化合物，其包含與蛋白質結合的蛋白質結合部分、促進所述蛋白質降解的標簽(識別元件)以及將蛋白質結合部分與標簽連接的共價接頭。在某些實施方案中，本專利技術亦涉及所述化合物用于調節靶蛋白的水平和/或活性的用途。在某些實施方案中，本專利技術涉及這樣的化合物、組合物和方法，其可用于通過在體內增強蛋白質的降解而治療或預防受試者中的疾病。在某些實施方案中，所述化合物可以是用于研究蛋白質降解的有用研究工具。在某些實施方案中，降解的蛋白質與疾病或病癥有關，所述疾病或病癥的病理學至少在某種程度上與蛋白質的過度表達或突變形式的蛋白質的表達有關。在某些實施方案中，所述化合物、組合物和方法對諸如感染、炎性病況、糖尿病、心血管疾病、癌癥和遺傳疾病等疾病的治療有用。在其它實施方案中，所述化合物、組合物和方法亦用作殺蟲劑和除草劑。本專利技術的其它方面、實施方案和優點在下文中詳細論述。附圖簡述 附圖說明圖1描述本專利技術化合物的實例。圖2描述本專利技術化合物及其與融合蛋白一起使用的實例。在這種情況下，HAL0、SNAP或CLIP蛋白為融合蛋白的部分，所述融合蛋白還包含待降解的蛋白質。圖3描述eDHFR-KRas D12融合蛋白的降解。使用MSCV逆轉錄病毒將eDHFR-KRasD12融合基因插入NIH3T3細胞。將這些細胞接種在48孔板中并用16 μΜ甲氧芐啶或甲氧芐啶-Boc3Arg處理，然后在指定的時間收獲。eDHFR-Ras在氨基端含有FLAG標簽并通過使用抗FLAG抗體的蛋白質印跡來測定。將微管蛋白用作上樣對照。圖4描述通過EA_Boc3Arg在Cos-1和HeLa細胞中降解內源性GST-。(A) Cos-1細胞中內源性GST-V的降解；(B) (A)中數據的定量；(C)環己酰亞胺處理的Cos-1細胞中內源性GST-V的降解；⑶環己酰亞胺處理的HeLa細胞中內源性GST-v的降解。圖5描述HeLa細胞裂解物中GST- α 1-HA和HeLa細胞中eDHFR-HA-GST的降解。蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Ve I ca本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：LK赫茲特倫，M龍，DR加拉帕利，
申請(專利權)人：布蘭代斯大學，
類型：
國別省市：