一種測定重組人膠質細胞源性神經營養因子活性的細胞學方法技術

一種測定重組人膠質細胞源性神經營養因子活性的細胞學方法,包括如下步驟：構建表達質粒pcDNA3.1-hGFRα1，然后制備穩定表達hGFRα1的HEK293細胞；構建表達質粒pcDNA3.1-hRET，再制備能夠同時表達hGFRα1和hRET以及熒光素酶報告系統的HEK293細胞；將待測rhGDNF加入到同時表達hGFRα1和hRET以及熒光素酶報告系統的HEK293細胞中，培養后測定熒光強度F1；同時設置沒有加入待測rhGDNF的空白對照組，培養后測定熒光強度F2；將F1、F2進行比較。本發明專利技術能夠有效測定重組人膠質細胞源性神經營養因子（rhGDNF）活性，測定結果準確可靠。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物工程
，具體涉及。
技術介紹
帕金森病，由Parkinson(1817)首先描述，是一種常見的中老年人神經系統變性疾病，帕金森病是老年人中第四位最常見的神經變性疾病，在> 65歲的人群中，1%患有此病，在> 40歲的人群中則為0.4%，本病也可在兒童期或青春期發病。白種人發病率最高，其次是黃種人。H)是一終身性疾病，迄今為止尚無根治的方法一旦患病則需要終身治療，由于手術治療價格昂貴而且有嚴格的手術指征，而基因治療和干細胞治療尚處于研究階段，因而藥物治療仍是目前治療H)的主要方法。膠質細胞源性神經營養因子(glialcell line-derived neurotrophic factor,GDNF)的神經營養作用主要是通過其兩類受體亞基介導，即膠質細胞源性神經營養因子受體alpha (GFRots)亞基和受體酪氨酸激酶Ret亞基。GFRots亞基靠其C端的磷酯酰肌醇鍵(GPI)錨定在細胞膜的外表面，屬膜外蛋白，不能直接轉導信號。GDNF首先與GFRa I受體結合形成⑶NF-GFRotl復合物，此復合物再與Ret結合形成三聚體復合物，引起Ret的二聚化，并引起酪氨酸殘基自磷酸化，從而引起下游的信號轉導，發揮GDNF的生理作用。體內外的許多實驗研究均證明⑶NF可以促進中腦黑質多巴胺能神經元，顱神經和脊髓運動神經元，腦干的去甲腎上腺素能神經元，基底前腦膽堿能神經元，背根神經節，交感神經元的存活。⑶NF在這些不同環境中的表達對于其在神經變性性疾病研究及治療有著重要的意義。直接將GDNF注入腦內到H)動物模型的黑質紋狀體系統內，可改善這些模型動物的行為學癥狀及其黑質紋狀體系統多巴胺能神經元的存活率。所以，GDNF以H)為適應癥，潛在的治療對象還包括坐骨性神經痛、周圍神經損傷后造成的慢性神經痛、其它神經退行性疾病以及男性生殖干細胞疾病，因此具有廣泛的社會效益和巨大的經濟效益。但是目前并沒有一種能夠有效的對重組人膠質細胞源性神經營養因子(rh⑶NF)活性進行檢測的細胞學方法。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供，從而消除上述
技術介紹
中缺陷。為解決上述技術問題，本專利技術的技術方案是:，包括如下步驟:S1、構建表達質粒pcDNA3.1-hGFRa 1，然后用轉染法制備穩定表達hGFR a I的HEK293 細胞；S2、構建表達質粒pcD NA3.Ι-hRET，然后以步驟SI中制備的穩定表達hGFR a I的HEK293細胞為基礎，用轉染法制備能夠同時穩定表達hGFRa I和hRET以及熒光素酶報告系統的HEK293細胞；S3、將待測rh⑶NF加入到步驟S2得到的同時穩定表達hGFRa I和hRET以及熒光素酶報告系統的HEK293細胞中，培養后測定熒光強度Fl ;同時設置沒有加入所述待測rh⑶NF的空白對照組，培養后測定熒光強度F2 ；S4、將F1、F2進行比較，若Fl > F2，則說明待測的rh⑶NF具有活性；若Fl ( F2，則說明待測的rhGDNF不具有活性。作為一種改進，步驟SI中，以pcDNA3.1_為表達載體，利用限制內切酶XhoI和Not I將載體線性化，再用T4DNA連接酶將hGFR a IcDNA連接至pcDNA3.1中，構建表達質粒pcDNA3.1-hGFRa I。作為一種進一步的改進，步驟SI中，轉染法的詳細步驟為:A、把2μ g pcDNA3.1-hGFR a I加入到110μ I Opt1-MEM培養基中，輕輕混勻后放置室溫備用；B、加 15μ I 的 Lipofectamine (DNA 轉染試劑)M 150 μ I Opt1-MEM 培養基中，輕輕混勻后放置室溫備用；C、將步驟A和·步驟B的液體混合,得到DNA-Lipofectamine混合物；D、將步驟C得到的DNA-Lipofectamine在室溫(25°C )放置30分鐘；E、然后加320 μ I Opt1-MEM培養基到步驟D的DNA-Lipofectamine混合物中，輕輕混勻備用；F、用2ml Opt1-MEM培養基洗HEK293細胞一次，然后取500 μ I步驟E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293細胞中；G、在37°C、5% 二氧化碳的細胞培養箱中培養5小時，然后去掉上清液，留下貼壁生長的HEK293細胞，換上新鮮配置的3ml DMEM培養液，且所述DMEM培養液中含體積百分比為10%的胎牛血清、以及總重為lwt%的青霉素、鏈霉素、谷氨酸、非必需氨基酸,在37°C、5% 二氧化碳的細胞培養箱中培養24小時；H、當細胞在培養皿底部的覆蓋率達到80%后，用生理鹽水清洗細胞，并加入新鮮配制的含G418的選擇性DMEM培養基對已轉染的細胞基因組中插入了 hGFRa I基因的陽性細胞進行篩選，所述選擇性DMEM培養基中含體積百分比為10%的胎牛血清、總重為lwt%的青霉素、鏈霉素、谷氨酸和非必需氨基酸，以及500 μ g/ml的G418 ;兩周后,得到穩定表達hGFRa I 的 HEK293 細胞。作為一種改進，步驟S2中，以pcDNA3.1_為表達載體，利用限制內切酶XhoI和NotI將載體線性化，再用T4DNA連接酶將hRET cDNA連接至pcDNA3.1-載體中，構建表達質粒為 pcDNA3.1-hRETο作為一種進一步的改進，步驟S2中，轉染法的詳細步驟為:A、把 2 μ g pcDNA3.1-hRET 加入到 110 μ I 含有 0.75 μ g pFR-Luc (熒光素酶報告基因載體)、0.25yg pFA2-Elkl (信號通路報告載體)的Opt1-MEM培養基中，輕輕混勻后放置室溫備用；B、加 15μ I 的 Lipofectamine (DNA 轉染試劑)M 150 μ I Opt1-ΜΕΜ 培養基中，輕輕混勻后放置室溫備用；C、將步驟 A 和步驟 B 的 DNA-Lipofactamine 液體混合，得到 DNA-Lipofectamine混合物；D、將步驟C得到的DNA-Lipofectamine混合物在室溫(25°C )下放置30分鐘；E、然后加320 μ I Opt1-MEM培養基到步驟D的DNA-Lipofectamine混合物中，輕輕混勻；F、用2ml Opt1-MEM培養基洗步驟SI得到的具有pcDNA3.1-hGFR α I的ΗΕΚ293穩定細胞株一次，然后取500 μ I步驟E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到ΗΕΚ293細胞中；G、在37°C 5% 二氧化碳的細胞培養箱中培養5小時，然后去掉上清液，換上新鮮配制的3ml DMEM培養液，且所述DMEM培養液中含體積百分比為10%的胎牛血清、以及總重為lwt%的青霉素、鏈霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，在溫度為37°C、5% 二氧化碳的培養箱中培養24小時；H、當細胞在培養皿底部的覆蓋率達到80%后，用3ml磷酸鹽緩沖液清洗細胞，然后加入Iml胰蛋白酶將細胞懸浮，收集并離心后，去掉上清液，并加入適量體積的Opt1-MHM培養基，且所述Opt1-MEM培養基中含有體積百分比為0.5%的胎牛血清、以及總重為lwt%的青霉素、鏈霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種測定重組人膠質細胞源性神經營養因子活性的細胞學方法,其特征在于：包括如下步驟：S1、構建表達質粒pcDNA3.1?hGFRα1，然后用轉染法制備穩定表達hGFRα1的HEK293細胞；S2、構建表達質粒pcDNA3.1?hRET，然后以步驟S1中制備的穩定表達hGFRα1的HEK293細胞為基礎，用轉染法制備能夠同時穩定表達hGFRα1和hRET以及熒光素酶報告系統的HEK293細胞；S3、將待測rhGDNF加入到步驟S2得到的同時穩定表達hGFRα1和hRET以及熒光素酶報告系統的HEK293細胞中，培養后測定熒光強度F1；同時設置沒有加入所述待測rhGDNF的空白對照組，培養后測定熒光強度F2；S4、將F1、F2進行比較，若F1＞F2，則說明待測的rhGDNF具有活性；若F1≤F2，則說明待測的rhGDNF不具有活性。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：曹杰，
申請(專利權)人：濰坊易思特生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：