藻類(lèi)細(xì)胞的制備方法以及化學(xué)物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)用試劑盒技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了一種藻類(lèi)細(xì)胞的制備方法，用于利用延遲發(fā)光來(lái)評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的毒性，其中包括使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞冷凍的工序。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及藻類(lèi)細(xì)胞的制備方法以及化學(xué)物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)用試劑盒。
技術(shù)介紹
在使用藻類(lèi)的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的毒性的情況下，必須以用液體培養(yǎng)或用瓊脂培養(yǎng)基等進(jìn)行維持的細(xì)胞為基礎(chǔ)實(shí)施原代培養(yǎng)(primary culture)以及繼代培養(yǎng)(subculture)并制備藻類(lèi)細(xì)胞，并將被檢物質(zhì)添加到制備好的藻類(lèi)細(xì)胞中來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。但是，維持藻類(lèi)細(xì)胞或者每個(gè)試驗(yàn)中進(jìn)行繼代培養(yǎng)都很麻煩而不便。為了消除這種麻煩，可以利用冷凍了的藻類(lèi)細(xì)胞(非專(zhuān)利文獻(xiàn)I以及2等)。通過(guò)就在試驗(yàn)之前解凍已冷凍了的藻類(lèi)細(xì)胞并利用解凍了的藻類(lèi)細(xì)胞，從而可以不對(duì)藻類(lèi)細(xì)胞實(shí)施繼代培養(yǎng)而能夠迅速地提供給試·驗(yàn)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開(kāi)第2005/062027號(hào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:桑野和可，2002年《藻類(lèi)的冷凍保存》；堀輝三 大野正夫 堀口健雄編“21世紀(jì)初的藻學(xué)的現(xiàn)狀”；日本藻類(lèi)學(xué)會(huì)，山形，108 111頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:森史等，“國(guó)立環(huán)境研究所微生物系統(tǒng)保存設(shè)施之藍(lán)藻和綠藻的冷凍保存”，Microbiol.Cult.Coll.，2002 年 6 月，45-55 頁(yè)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 J.G.Day等，“藻類(lèi)的超低溫保存”，分子生物學(xué)方法，38卷，冷凍保存與冷凍干燥實(shí)驗(yàn)指南，81-89頁(yè)
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專(zhuān)利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題作為冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞，通常使用穩(wěn)定期的細(xì)胞。這是因?yàn)槟軌驕p少解凍而制備成具有生存能力的細(xì)胞的時(shí)間，而且脂質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)作為細(xì)胞保護(hù)劑進(jìn)行工作(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。在使用藻類(lèi)的評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的毒性的方法中，作為較經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)測(cè)試指南TG201所規(guī)定的抑制生長(zhǎng)試驗(yàn)更迅速并且更簡(jiǎn)便的方法，本專(zhuān)利技術(shù)人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了利用藻類(lèi)的延遲發(fā)光的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)I)。然而，本專(zhuān)利技術(shù)人發(fā)現(xiàn):如果冷凍穩(wěn)定期的藻類(lèi)細(xì)胞并解凍來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)的話，則與冷凍前的細(xì)胞相比較生長(zhǎng)會(huì)變得不良。細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)影響到利用延遲發(fā)光的毒性評(píng)價(jià)，所以如果使用穩(wěn)定期的藻類(lèi)細(xì)胞作為冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的話，則會(huì)產(chǎn)生不能夠進(jìn)行與使用冷凍前的藻類(lèi)細(xì)胞的情況相同等的毒性評(píng)價(jià)的問(wèn)題。因此，有必要制備解凍后的生長(zhǎng)良好的藻類(lèi)的冷凍細(xì)胞。解決技術(shù)問(wèn)題的手段本專(zhuān)利技術(shù)人為了解決上述技術(shù)問(wèn)題反復(fù)作了悉心研究，發(fā)現(xiàn):通過(guò)使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(logarithmic growth phase)的細(xì)胞作為冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞,解凍后的藻類(lèi)細(xì)胞能夠順利地進(jìn)行繁殖，以至于完成了本專(zhuān)利技術(shù)。S卩，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種用于利用延遲發(fā)光進(jìn)行的化學(xué)物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)的藻類(lèi)細(xì)胞的制備方法，其中包括使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞冷凍的工序。如果使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞冷凍，則解凍后的藻類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)將變得良好，并且能夠獲得與冷凍前同等強(qiáng)度的延遲發(fā)光的發(fā)光量。優(yōu)選相對(duì)于冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的總數(shù)，50%以上的藻類(lèi)細(xì)胞具有4.以上的粒徑。另外，優(yōu)選冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的粒徑分布曲線顯示雙峰分布。通過(guò)使用像這樣的藻類(lèi)細(xì)胞，解凍后的藻類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)將變得更為良好，對(duì)于延遲發(fā)光來(lái)說(shuō)也將變得容易獲得與冷凍前同等的強(qiáng)度的發(fā)光量。另外，優(yōu)選在使用以株號(hào)NIES-35被保存于日本國(guó)立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作為冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的情況下，相對(duì)于所冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞總數(shù)，55%以上的藻類(lèi)細(xì)胞具有顯示雙峰分布的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。另外，優(yōu)選在使用以株號(hào)NIES-35被保存于日本國(guó)立環(huán)境研究所的綠藻的情況下，相對(duì)于粒徑小的峰處的細(xì)胞數(shù)與粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)之和，顯示雙峰分布的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)為50%以上。在使用以株號(hào)NIES-35被保存的綠藻的情況下，通過(guò)使用如以上所述的粒徑分布的藻類(lèi)細(xì)胞，解凍后的藻類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)將變得更為良好。另外，優(yōu)選在使用以ATCC編號(hào)22662被保存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)中的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作為冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的情況下，相對(duì)于冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的總數(shù)，46%以上的藻類(lèi)細(xì)胞具有顯示雙峰分布的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。另外，優(yōu)選在使用以ATCC編號(hào)22662被保存于美國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻的情況下，相對(duì)于粒徑小的峰處的細(xì)胞數(shù)與粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)之和，顯示雙峰分布的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)為37%以上。在使用以ATCC編號(hào)22662被保存的綠藻的情況下，通過(guò)使用如以上所述的粒徑分布的藻類(lèi)細(xì)胞，解凍后的藻類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)將變得更為良好。另外，本專(zhuān)利技術(shù)的方法優(yōu)選在使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞冷凍的工序之前，進(jìn)一步包括:在培養(yǎng)液中培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞的工序，離心分離含有該藻類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)液的工序，以及從藻類(lèi)細(xì)胞中完全除去由離心分離分離出的培養(yǎng)上清液的工序。通過(guò)從藻類(lèi)細(xì)胞中完全除去培養(yǎng)上清液，從而減少冷凍、解凍對(duì)延遲發(fā)光圖形的影響，并且容易獲得與冷凍前的細(xì)胞同等的延遲發(fā)光圖形。再有，本專(zhuān)利技術(shù)的方法優(yōu)選包括在-80°C以下的溫度下維持被冷凍的所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞的工序。通過(guò)在_80°C以下的溫度下進(jìn)行維持，從而就能夠防止冷凍中的細(xì)胞發(fā)生損傷，并且冷凍后的藻類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)將變得更為良好。另外，本專(zhuān)利技術(shù)是提供一種包含被冷凍的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞的利用延遲發(fā)光的化學(xué)物質(zhì)毒性評(píng)價(jià)用的試劑盒。通過(guò)使用這樣的試劑盒，從而就能夠簡(jiǎn)易而且迅速地進(jìn)行利用延遲發(fā)光的化學(xué)物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)。優(yōu)選相對(duì)于所述被冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的總數(shù)，50%以上的藻類(lèi)細(xì)胞具有4.5 y m以上的粒徑，另外，優(yōu)選藻類(lèi)細(xì)胞的粒徑分布曲線顯示雙峰分布。另外，優(yōu)選包含于上述毒性評(píng)價(jià)試劑盒中的被冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞是以株號(hào)NIES-35被保存于日本國(guó)立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata),相對(duì)于被冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞總數(shù)，55%以上的藻類(lèi)細(xì)胞具有顯示雙峰分布的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑，優(yōu)選相對(duì)于粒徑小的峰處的細(xì)胞數(shù)與粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)之和，顯示雙峰分布的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)為50%以上。另外，優(yōu)選包含于上述毒性評(píng)價(jià)試劑盒中的被冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞是以ATCC編號(hào)22662被保存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata),相對(duì)于被冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的總數(shù)，46%以上的藻類(lèi)細(xì)胞具有顯示雙峰分布的粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑，優(yōu)選相對(duì)于粒徑小的峰處的細(xì)胞數(shù)與粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)之和，顯示雙峰分布的粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)為37%以上。另外，包含于上述毒性評(píng)價(jià)試劑盒中的被冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞優(yōu)選由包括以下工序的方法進(jìn)行制備:在培養(yǎng)液中培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞的工序，離心分離含有該藻類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)液的工序，從藻類(lèi)細(xì)胞中完全除去由離心分離分離出的培養(yǎng)上清液的工序，以及冷凍余下的藻類(lèi)細(xì)胞的工序。另外，包含于上述毒性評(píng)價(jià)試劑盒中的藻類(lèi)細(xì)胞優(yōu)選在-80°C以下的溫度下被維持。專(zhuān)利技術(shù)的效果根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的藻類(lèi)細(xì)胞的制備方法，因?yàn)槔鋬鲆约敖鈨鲋蟮脑孱?lèi)細(xì)胞的繁殖良好，所以在進(jìn)行利用延遲發(fā)光的化學(xué)物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)的時(shí)候，能夠與冷凍前的藻類(lèi)細(xì)胞同樣地進(jìn)行使用。再有，根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的利用延遲發(fā)光的化學(xué)物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)用試劑盒，能夠簡(jiǎn)易而且迅速地進(jìn)行化學(xué)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】2010.09.08 JP 2010-2011421.一種藻類(lèi)細(xì)胞的制備方法，其特征在于: 用于利用延遲發(fā)光來(lái)評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的毒性， 包括使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞冷凍的工序。2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 相對(duì)于所述冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的總數(shù)，50%以上的藻類(lèi)細(xì)胞具有4.5 y m以上的粒徑。3.按權(quán)利要求1或者2所述的方法，其特征在于: 所述冷凍的藻類(lèi)細(xì) 胞的粒徑分布曲線顯示雙峰分布。4.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 所述所冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞是以株號(hào)NIES-35被保存于日本國(guó)立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對(duì)于所述冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞的總數(shù)，55%以上的藻類(lèi)細(xì)胞具有所述粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。5.按權(quán)利要求3或者4所述的方法，其特征在于: 所述冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞是以株號(hào)NIES-35被保存于日本國(guó)立環(huán)境研究所的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對(duì)于粒徑小的峰處的細(xì)胞數(shù)與粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)之和，所述粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)為50%以上。6.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 所述冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞是以ATCC編號(hào)22662被保存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對(duì)于所述冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞總數(shù)，46%以上的藻類(lèi)細(xì)胞具有所述粒徑分布曲線上的谷值粒徑以上大小的粒徑。7.按權(quán)利要求3或者6所述的方法，其特征在于: 所述冷凍的藻類(lèi)細(xì)胞是以ATCC編號(hào)22662被保存于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的綠藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相對(duì)于粒徑小的峰處的細(xì)胞數(shù)與粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)之和，所述粒徑分布曲線的粒徑大的峰處的細(xì)胞數(shù)為37%以上。8.按權(quán)利要求1 7中的任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于: 在使所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞冷凍的工序之前，進(jìn)一步包括: 在培養(yǎng)液中培養(yǎng)所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類(lèi)細(xì)胞的工序， 離心分離含有所述藻類(lèi)細(xì)胞的所述培養(yǎng)液的工序，以及 從所述藻類(lèi)細(xì)胞中完全除去由所述離心分離所分離出的培養(yǎng)上清液的工序。9.按權(quán)利要求1 8中的任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于: 進(jìn)一步包括在_80°C以下的溫度下維持被冷凍的所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：數(shù)村公子，竹內(nèi)彩乃，勝又政和，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：浜松光子學(xué)株式會(huì)社，
類(lèi)型：
國(guó)別省市：