本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種極耐熱糖苷酶基因在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)與應(yīng)用，該極耐熱糖苷酶基因的DNA序列SEQ?NO：1通過(guò)密碼子的替換和誘導(dǎo)條件的改變，實(shí)現(xiàn)了該酶在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，酶活達(dá)到13U/mL，該糖苷酶具有極強(qiáng)的耐熱性能和特異性降解人參皂苷Rb1為Rd的能力，該酶在90℃、pH4.8的條件下酶活最高，在溫度70-100℃、pH4.8-8.0的范圍內(nèi)，均保持較高的酶活，該酶對(duì)葡萄糖的耐糖系數(shù)Ki為1.5mol/L，該酶1U/mL在90℃、pH5.2、5％甲醇條件下30min可將99％人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd，該極耐熱糖苷酶性質(zhì)優(yōu)異，可應(yīng)用于苷元類(lèi)物質(zhì)的酶法轉(zhuǎn)化。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于基因工程及生物質(zhì)利用
，尤其涉及。
技術(shù)介紹
人參Panax ginseng是亞洲傳統(tǒng)的名貴中藥材,具有生物活性廣泛,藥理作用獨(dú)特等特點(diǎn)，但其化學(xué)成分復(fù)雜。隨著分析技術(shù)的革新，人參主要的化學(xué)成分得到了進(jìn)一步的明確。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷是人參主要的生物活性物質(zhì)，到目前為止，已經(jīng)分離鑒定40余種人參皂苷單體，其中5種主要皂苷(人參皂苷Rbl、Rb2、Re和Rgl)占總皂苷的80%以上，其它的阜苷(Rd、Rg3、Rh2和Compound K等)含量很低,稱(chēng)為稀有阜苷(Applied MicrobiologyandBiotechnology，2012，94:673-682)。由于對(duì)單體進(jìn)行生物活性研究，易于闡明其確切的藥理作用，發(fā)現(xiàn)活性較強(qiáng)的化合物，因此越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)人參皂苷單體進(jìn)行了生理功能的研究。人參皂苷Rd藥理作用廣泛，有些藥理作用與其它人參皂苷類(lèi)似，但是Rd具有許多獨(dú)特的藥理作用，如保護(hù)心腦血管、清楚自由基、促進(jìn)T細(xì)胞增殖、提高天然殺傷細(xì)胞(NK)活性、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用(中草藥2009，40 (5):832-836)。但是，由于人參皂苷Rd在人參屬植物中含量很低，而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成至今還沒(méi)有成功，目前只能通過(guò)從人參等藥用植物中提取，但其成本太高，從而限制了 Rd的進(jìn)一步研究和應(yīng)用。而主要皂苷Rbl和Re與Rd的差別僅僅是多一個(gè)葡萄糖基或者阿拉伯糖基，因此通過(guò)對(duì)人參皂苷Rbl和Re轉(zhuǎn)化得到Rd是可行的方法。對(duì)于人參皂苷Rbl的轉(zhuǎn)化，有化學(xué)轉(zhuǎn)化法和生物轉(zhuǎn)化法。化學(xué)轉(zhuǎn)化法因其反應(yīng)劇烈、選擇性差、副產(chǎn)物多等缺點(diǎn)而不被采用。生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和，特異性好等特點(diǎn)，而受到青睞。目前人參皂苷Rbl生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Rd主要有微生物轉(zhuǎn)化法和酶轉(zhuǎn)化法，主要存在以下缺點(diǎn):(I)大多數(shù)微生物或酶都來(lái)源于常溫，溫度穩(wěn)定性差；(2)高濃度的底物對(duì)轉(zhuǎn)化有抑制作用；(3)產(chǎn)物葡萄糖對(duì)轉(zhuǎn)化的酶有抑制作用；(4)轉(zhuǎn)化的專(zhuān)一性不強(qiáng)；(5)轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)；(6)生產(chǎn)成本過(guò)高。Kim等從70多株好氧菌中篩選到12株菌可以將人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rd，底物濃度為0.47g/L ;而能將人參皂苷Rbl較完全轉(zhuǎn)化的3株細(xì)菌，均有其它皂苷的副產(chǎn)物(The Journal of Micobiology，2005，43:456-462)。呂國(guó)忠等人發(fā)現(xiàn)一種人參內(nèi)生灰綠梨頭霉菌能專(zhuān)一性的轉(zhuǎn)化Rbl成人參皂苷Rd，但轉(zhuǎn)化周期較長(zhǎng)，且轉(zhuǎn)化率不高(中國(guó)專(zhuān)利技術(shù)專(zhuān)利，專(zhuān)利公開(kāi)號(hào):CN 102080048 A)。因此，尋找高效、低成本的生物酶轉(zhuǎn)化人參皂苷Rbl生產(chǎn)人參皂苷Rd具有重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種極耐熱糖苷酶基因及其可溶性表達(dá)與應(yīng)用，旨在解決目前無(wú)法提供用于人參皂苷Rbl生產(chǎn) 人參皂苷Rd的高效、低成本生物酶的問(wèn)題。本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種極耐熱糖苷酶基因，該極耐熱糖苷酶基因的DNA序列如SEQ NO:1所示。進(jìn)一步，該極耐熱糖苷酶基因的獲取過(guò)程為:參照NCBI上已發(fā)表的T.thermarum DSM 5069極耐熱糖苷酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，登錄號(hào):YP 004660190.1，以提取的T.thermarum DSM 5069基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得極耐熱糖苷酶基因全序列。進(jìn)一步，該極耐熱糖苷酶基因克隆到pET_28a載體，可得到包含極耐熱糖苷酶基因核苷酸序列的重組質(zhì)粒pET-28a-bgl。進(jìn)一步，所述重組質(zhì)粒pET-28a-bgl的制備方法為:步驟一，以Thermotoga thermarum DSM 5069的基因組為模板，以Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到極耐熱糖苷酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，引物為:Pl:CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCT Gl TCGG CC, CG AGCk TGGCG^TiX AAGTTGAAATGGGATATG,下劃線(xiàn)表示Nco I，斜體加粗表示優(yōu)勢(shì)密碼子替換的位點(diǎn)；P2: CCCCTCGAGCAT OC6CCAGkT]T CGTA TG G GCTT TT CA GGTAGTTGTGAAAGlGCCGTTGTCCCTTCTTTG,下劃線(xiàn)表示Xho I，斜體加粗表示優(yōu)勢(shì)密碼子替換的位點(diǎn)；步驟二，將步驟一所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pET_28a分別用Nco I和Xho I雙酶切，并分別割膠回收，16°C過(guò)夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得含有極耐熱糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pET_28a_bgl。進(jìn)一步，極耐熱糖苷酶的可溶性表達(dá)的實(shí)現(xiàn)方法為:將重組質(zhì)粒pET-28a_bgl轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (DE3)，挑單菌落到搖瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)和誘導(dǎo)的溫度為37°C，不加入誘導(dǎo)劑IPTG，12h后收集細(xì)胞，超聲波破細(xì)胞，并利用Ni親和層析柱進(jìn)行重組酶的純化，最終得到極耐糖苷酶的純酶。進(jìn)一步，極耐熱糖苷酶的定性為:在95°C、pH 4.8的條件下酶活最高，該酶在溫度70-100°C、pH 4.8-8.0的范圍內(nèi)，均保持較高的酶活，該酶對(duì)葡萄糖的耐糖系數(shù)Ki為1.5mol/L。進(jìn)一步，極耐熱糖苷酶在轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb I為Rd中的應(yīng)用。進(jìn)一步，該極耐熱糖苷酶應(yīng)用于對(duì)人參皂苷Rbl的轉(zhuǎn)化時(shí)，該酶lU/mL在90°C、pH5.2、5%甲醇條件下30min，可將99%人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化為Rd。本專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種極耐熱糖苷酶基因在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)與應(yīng)用，該極耐熱糖苷酶基因的DNA序列如SEQ NO:1所示，通過(guò)密碼子的替換和誘導(dǎo)條件的改變，實(shí)現(xiàn)了該酶在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，酶活達(dá)到13U/mL，該糖苷酶具有極強(qiáng)的耐熱性能和特異性降解人參皂苷Rbl為Rd的能力，該酶在90°C、pH 4.8的條件下酶活最高，在溫度70-100°C、pH 4.8-8.0的范圍內(nèi)，均保持較高的酶活，該酶對(duì)葡萄糖的耐糖系數(shù)Ki為1.5mol/L，該酶lU/mL在90°C、pH 5.2、5%甲醇條件下30min可將99%人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rd，本專(zhuān)利技術(shù)提供的極耐熱糖苷酶性質(zhì)優(yōu)異， 可應(yīng)用于人參皂苷酶法轉(zhuǎn)化。附圖說(shuō)明圖1是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例提供的極耐熱糖苷酶可溶性表達(dá)的SDS-PAGE蛋白電泳圖，I為蛋白 marker ;2，5，8，11，14，17 為全細(xì)胞蛋白；3，6，9，12，15，18 為沉淀蛋白；4，7，10，13，16，19為可溶性蛋白；圖2是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例提供的極耐糖苷酶純蛋白的SDS-PAGE蛋白電泳圖，I為蛋白marker ;2為大腸桿菌JM109(DE3)的全細(xì)胞蛋白；3為大腸桿菌JM109 (DE3)帶重組質(zhì)粒pET-28a-bgl的全細(xì)胞蛋白；4為極耐熱糖苷酶的純酶；圖3是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例提供的溫度和pH對(duì)極耐熱糖苷酶活性的影響；圖4是本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例提供的極耐熱糖苷酶對(duì)人參皂苷Rbl的轉(zhuǎn)化薄層圖。具體實(shí)施方式為了使本專(zhuān)利技術(shù)的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本專(zhuān)利技術(shù)，并不用于限定專(zhuān)利技術(shù)。 本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種極耐熱糖苷酶基因，該極耐熱糖苷酶基因的DNA序列如SEQ NO:1所示。在本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例中，該極耐熱糖苷酶基因本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種極耐熱糖苷酶基因，其特征在于，該極耐熱糖苷酶基因的獲取過(guò)程為：參照NCBI上已發(fā)表的T.thermarum?DSM?5069極耐熱糖苷酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，登錄號(hào)：YP_004660190.1，以提取的T.thermarum?DSM?5069基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得極耐熱糖苷酶基因全序列；該極耐熱糖苷酶基因克隆到pET?28a載體，可得到包含極耐熱糖苷酶基因核苷酸序列的重組質(zhì)粒pET?28a?bgl。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種極耐熱糖苷酶基因，其特征在于，該極耐熱糖苷酶基因的獲取過(guò)程為:參照NCBI上已發(fā)表的T.thermarum DSM 5069極耐熱糖苷酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，登錄號(hào):YP_004660190.1，以提取的T.thermarum DSM 5069基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得極耐熱糖苷酶基因全序列； 該極耐熱糖苷酶基因克隆到pET-28a載體，可得到包含極耐熱糖苷酶基因核苷酸序列的重組質(zhì)粒pET-28a_bgl。2.如權(quán)利要求1所述的極耐熱糖苷酶基因，其特征在于，所述重組質(zhì)粒pET-28a-bgl的制備方法為: 步驟一，以Thermotoga thermarum DSM 5069的基因組為模板，以Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到極耐熱糖苷酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，引物為:Pl:CCCCCATGGGTTTTCCAAAGGATTTTCT Gl TCGG CG AGCk TGGC CoG CT T O: AAGTTGAAATGGGATATG，下劃線(xiàn)表示Nco I，斜體加粗表示優(yōu)勢(shì)密碼子替換的位占.P2:CCCCTCGAGCAT OC OC CACGTA TG G GCTl TT CA GGTAGTTGTG AAAOCG/GCCGTTGTCCCTTCTTTG,下劃線(xiàn)表示Xho I，斜...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙林果，裴建軍，曹福亮，王飛，汪貴斌，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：南京林業(yè)大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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