本發明專利技術涉及鞘氨醇膠多糖制備領域。更具體地，本發明專利技術涉及一種粘液形成突變體鞘氨醇單胞菌菌株，其含有至少一種有利于粘液形式的多糖產生的基因修飾，其中所述突變體鞘氨醇單胞菌菌株含有基因M、基因N或這兩個基因中的突變、插入或缺失。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及鞘氨醇膠多糖制備領域。特別地，其涉及用于改進制備鞘氨醇膠的菌株的定點基因方法。
技術介紹
鞘氨醇單胞菌(sphingomonas)菌株，例如ATCC53159和ATCC31461產生大量的莢膜多糖。盡管在某些條件下，多糖可以由細胞釋放[5，6]，但在具有豐富碳源的生長過程中(如發酵)，多糖牢固附著于細胞表面。提高丟坦糖膠(diutan)和吉蘭糖膠(gellan)發酵產率的嘗試受到莢膜性質的多糖的限制，所述莢膜性質的多糖可以破壞營養素的吸收。另夕卜，如果用于多糖的生物合成的位點數量有限，就會有由各細胞能產生多糖的最大量。已經觀察到多糖吉蘭糖膠與細胞凝集有關，這是由于不產生任何多糖的突變體在懸浮液中均勻地生長[3]。這些細胞凝集塊可以干擾多種技術，例如通過光密度測定細胞數量，細胞的離心(例如用于分離DNA或蛋白質)，以及用于多糖純化的細胞分離或裂解。先前尚未確定與鞘氨醇單胞菌中多糖附著于細胞表面有關的附著機制和基因。已經分離了以粘液形式產生多糖的鞘氨醇單胞菌菌株ATCC31461、ATCC31555、ATCC31554和ATCC21423的誘導突變體，但是未確定突變基因，且未公開誘導和篩選突變體的方法[10]。已經分離了用于吉蘭糖膠[3，8]、 丟坦糖膠[I]和鞘氨醇膠S-88[9]生物合成的基因。許多這些基因的功能通過生物化學試驗給出或者通過與數據庫例如GenBank中的已知功能的基因的同源性給出。例如，已經鑒定了與四糖重復單元[7，8]的裝配和前體dTDP-L-鼠李糖[3，9]的合成有關的基因。預期僅影響多糖附著于細胞表面的基因仍具有產生多糖的表型(即固體培養基和粘性發酵液上的粘液樣菌落)。除了不在基因簇中的用于吉蘭糖膠合成的四種基因外，還描述了跨越21kb的18種用于吉蘭糖膠生物合成的基因的基因簇。Harding N.E., Y.N.Patel, and R.Coleman,2004。伊樂藻鞘氨醇單胞菌ATCC31461中具有吉蘭糖膠多糖生物合成所需的基因的結構。JInd Microbiol Biotech31:70_82，參考文獻 3。其 DNA 序列于 2003 年 6 月存放于 GenBank中(登錄號AY217008)。基因簇中的基因有gelM、gelN以及gell。構建了大多數相鄰基因gelM和gelN的缺失。通過插入滅活gell基因。gelM-gelN缺失株和gell突變株顯示產生數量有所減少的吉蘭糖膠和更具流動性的發酵液，且顯示所產生的吉蘭糖膠具有與野生株的吉蘭糖膠相同的組成。多糖至細胞的附著未有報道。伊樂藻鞘氨醇單胞菌的gelR、gelS及gelG基因似乎以與S_88sps基因簇中相同的順序存在于操縱子中，但不鄰近18個基因的基因簇中的基因(參考文獻3)。GelR蛋白較其S-88同源物稍小￠59和670個氨基酸相比)，具有49%的同源性，且與表層蛋白和其他膜蛋白具有同源性。gelR、gelS及gelG基因的DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登錄號AY220099)。該報道中未構建gelR的突變(參考文獻3)。Yamazaki等報道在基因spsR中具有突變的菌株仍為粘液樣，表明它們產生多糖，但多糖不具有流變學或附著于細胞的特征([9]和 T.J.Pollock 等，DNA segments and methods for increasingpolysaccharide production.U.S.Patent N0.5, 854, 034)。Yamazaki描述了四種鞘氨醇單胞菌菌株的典型突變體，其產生作為粘液而非附著于細胞的多糖。美國專利第6，605，461號。Yamazaki未描述如何篩選粘液表型的誘變培養物。Yamazaki未鑒定出哪個基因或哪些基因被誘變。Sa-Correia綜述了關于吉蘭糖膠合成的基因的分離的工作。Sa-Correia 1.,A.M.Fialho, P.Videira, L.M.Moreira, A.R.Marques and H.Albano0 Gellan gumbiosynthesis in Sphingomonas paucimobilis ATCC31461:Genes, enzymes andexopolysaccharide production engineering.J Ind Microbiol Biotechnol.29:170-176。Sa-Correia描述了某些基因的部分測序，包括urf32和urf26(=上述的參考文獻3的gelM和gelN)。這些基因的完整序列于2003年4月存放于GenBank (GenBank登錄號AY242074)。這些基因的功能未有報道。在GenBank遞交中，僅分別將基因urf32和urf26指定為推定的膜蛋白和推定的運輸蛋白。未存放gell或gelR的序列。Coleman描述了用于丟坦糖膠生物合成的基因的分離和某些基因功能的研究。R.Coleman,2001,Cloning and analysis of Sphingomonas sp.ATCC53159polysaccharidegenes.Master’ s Thesis, San Diego State University。描述了 dpsM 和 dpsN 基因(由Coleman命名為orf3和orf4)，但未指明功能。描述了來自鞘氨醇單胞菌菌株ATCC31554的用于S-88多糖的生物合成的基因簇。Yamazaki M., L Thorne, M.Mikolajczak, R.ff.Armentrout 和 T.J.Pollock.1996.Linkageof genes essential for synthesis of a polysaccharide capsule in Sphingomonasstrain S88.J Bacterioll78:2676_2687 和美國專利第 5，854，034 號。未描述基因 urf32和urf26的功能(dpsM、gelM和dpsN、gelN的同源物)和spsl (gell、dpsl的同源物)。將spsR基因(gelR、dpsR的同源物)描述為編碼與細菌和真菌多糖裂解酶大不相似的蛋白。其DNA序列存放于GenBank中(登錄號U51197)。本領域仍需要改進制備工業上實用的鞘氨醇膠的方法和改進鞘氨醇膠的性質。
技術實現思路
本專利技術提供了一種制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法，所述鞘氨醇單胞菌屬細菌含有選自鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和N的一種基因或兩種基因的突變，所述方法包括:分離鞘氨醇單胞菌屬的第一種細菌的基因組D`NA片段，其中所述片段含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的基因M和/或N的全部或部分；誘導所述片段突變以形成突變的片段；將所述突變的片段導入鞘氨醇單胞菌屬的第二種細菌，其中所述第二種細菌含有鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N ;分離所述第二種細菌的子代，其中所述突變的片段已經整合入基因組并置換所述第二種細菌的鞘氨醇膠多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。在本專利技術所述制備鞘氨醇單胞菌屬細菌的方法的實施方案中，可通過擴增來分離所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種組合物，其含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予流體對于由菌株ATCC53159產生的等量丟坦糖膠增加的粘度，其中所述丟坦糖膠多糖來自突變體鞘氨醇單胞菌菌株ATCC53159dpsM#1或dpsM#5，所述突變體鞘氨醇單胞菌菌株在dpsM基因中具有缺失突變。
【技術特征摘要】
2005.02.04 US 60/649,5591.一種組合物，其含有丟坦糖膠多糖，所述丟坦糖膠多糖賦予流體對于由菌株ATCC53159產生的等量丟坦糖膠增加的粘度，其中所述丟坦糖膠多糖來自突變體鞘氨醇單胞菌菌株ATCC53159dpsM#l或dpsM#5，所述突變體鞘氨醇單胞菌菌株在dpsM基因中具有缺失突變。2.權利要求1所述的組合物，其中所述增加的粘度為大于菌株ATC...
【專利技術屬性】
技術研發人員：南茜·E·哈丁，帕特洛·雅美尼，拉塞爾·J·科爾曼，
申請(專利權)人：CP凱爾科美國公司，
類型：發明
國別省市：
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