本發明專利技術涉及分子生物學領域，具體的說是一種半滑舌鰨NK-lysin及其應用。NK-lysin為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。應用方法：以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增，PCR產物連接表達載體后得質粒pCNK1，將其注射魚類，即能顯著增強魚類的抗病毒和抗細菌能力。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學領域，具體的說是一種魚類NK-1ysin效應因子及其應用。
技術介紹
細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)和自然殺傷細胞(natural killer cell，NKC)是細胞免疫的主要效應細胞。這些細胞在受到刺激時分泌一系列引起祀細胞凋亡和殺傷的效應因子，其中一種即為NK-lysin。NK-1ysin是saposin家族的一員，具有典型的saposin結 構域。在哺乳動物中，NK-1ysin是一種抗菌肽，具有廣譜的抑菌活性。因此，NK-1ysin在細菌性疾病的防治中有良好的應用前景。ΝΚ-lysin目前只在五種硬骨魚中發現，但其功能、應用等尚待研究。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種ΝΚ-lysin效應因子及其應用。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為:一種魚類ΝΚ-lysin效應因子，ΝΚ-lysin為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。NK-1 ysin效應因子的制備方法，以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴±曾，PCR產物純化后與質粒PIRES2-EGFP用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為含SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的質粒pCNKl ;所述Fl為5， -GATATCATGAACAAATCTCCAATCC-3， ；R1 為 5， -GATATCGTTGTTTGGATAGAAGAGGA-3，。ΝΚ-lysin效應因子的應用，所述ΝΚ-lysin效應因子用于制備抗細菌或病毒的藥物。將含SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的質粒pCNKl在PBS中稀釋至200ug/ml。本專利技術具有如下優點:本專利技術的NK-1ys in表達質粒注射魚類后能夠明顯提高魚類的抗病毒和抗細菌感染能力。具體實施例方式下面結合實施例對本專利技術作進一步說明。實施例旨在對本專利技術進行舉例描述，而非以任何形式對本專利技術進行限制。在本專利技術實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法:1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應試劑盒。2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)。3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術有限公司”，北京。實施例1本專利技術的NK-1ysin為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID N0.1 為:MNKSPILLFCILAACSVWSVHGKSQEMNIDDEEPAEVELPVEAKPPGLCWGCKWALNKVKKAMTQKETYEKVKAR LIKICNKIGFLKSRCHKFVITHLDELVEELSTTDDVKTICVNVKACNPKEPSHLLFYPNN(a)序列特征: 長度:135 (有效作用區域47 — 121) 類型:氨基酸序列籲鏈型:單鏈 拓撲結構:線性(b)分子類型:蛋白質(C)假設:否(d)反義:否( e )最初來源:半滑舌鰨結構特點:該蛋白預期含有一個Saposin B功能域(氨基酸47 — 121)。實施例2NK-1ysin表達質粒pCNKl的構建:以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR條件為:94 V 60s預變性模板DNA，然后94 °C 40s, 50 V 60s, 72 V 60s, 5個循環后改為940C 40s, 58°C 60s, 72°C 60s, 30個循環后再在72°C延伸反應7 — IOmin0 PCR產物用天根的相應試劑盒純化。將表達載體pIRES2-EGFP (購于美國Clontech公司)用限制性內切酶SmaI酶切后回收5kb片段，將其與上述純化的PCR產物用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培養基上培養18 — 24小時，篩選轉化子提取質粒，命名為pCNKl。通過DNA測序分析證明了 pCNKl為含有實施例1NK-1ysin序列的表達質粒。所述LB組成成分按重量百分比計:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97.5%蒸餾水。所述 Fl 為 5’ -GATATCATGAACAAATCTCCAATCC-3’ ;R1 為 5’ -GATATCGTTGTTTGGATAGAAGAGGA-3，。實施例3NK-1ys in表達質粒pCNKl的應用步驟I)質粒注射將上述實施例2的pCNKl在PBS中稀釋至200ug/ml，即為pCNKl稀釋液。將20條半滑舌鰨(重約5.1g)隨機分為4組，每組5條。將這4組分別命名為A、B、C和D。將A和C組的每條魚分別注射50 ulpCNKl稀釋液，將B和D組(對照組)的每條魚分別注射50 ulPBS。所述PBS組 成成分按重量百分比計:0.8 % NaCl, 0.02 % KCl, 0.358 %Na2HPO4.12H20, 0.024% NaH2PO4,余量為水。步驟2)細菌和病毒懸液制備在LB培養基中培養鰻弧菌C312至OD6tltl為0.8，然后離心(5000g，4 V，IOmin),收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為I xl07cfu/ml，即為鰻弧菌懸液。將細胞腫大病毒RBIV-Cl (具體制備方法見Zhang M, Xiao Z, HuY, Sun L.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathusfasciatus (Temminck&Schlege), in China.Aquae Res.2012; 43:556 - 64)于 PBS 中稀釋至5xl05copies/ml,即為病毒懸液。所所述鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為:CGMCC N0.6250，保藏日期2012.6.21，分類命名為鰻弧菌(Vibrioanguillarum)，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號。步驟3)攻毒感染 在上述步驟I)注射后第7天，將A和B組的每條魚注射50ul上述步驟2)的鰻弧菌懸液，將C和D組的每條魚注射50ul上述步驟2)的病毒懸液。在感染后24h，取魚腎臟和脾臟組織。將A和B組魚的組織在2ml PBS中勻漿，將IOOul勻漿液涂布于LB平板。將平板置于30°C培養48h，計算出現的菌落數。利用DNA提取試劑盒(購于天根生化科技(北京)有限公司”)從C和D組魚腎臟和脾臟組織中提取DNA，用絕對定量PCR法檢測組織中病毒含量(具體方法見上述參考文獻)。結果表明A組魚腎臟和脾臟的細菌數(分別為IxlO5和8xl05)顯著(P〈0.01)低于B組魚腎臟和脾臟的細菌數(分別為4.2xl05和2.7xl06)；C組魚腎臟和脾臟的病毒數(分別為IxlO8和IxlO9)顯著(P〈0.01)低于D組魚腎臟和脾臟的病毒數(分別為3.4x本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種魚類NK?lysin效應因子，其特征在于：NK?lysin為序列表SEQID?No.1中的氨基酸序列所示。
【技術特征摘要】
1.一種魚類NK-1ysin效應因子，其特征在于:NK_lysin為序列表SEQID N0.1中的氨基酸序列所示。2.—種權利要求1所述NK-1ysin效應因子的制備方法，其特征在于: 以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴±曾，PCR產物純化后與質粒PIRES2-EGFP用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌，篩選轉化子提取質粒，即為含SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的質粒pCNKl ;所述F...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張敏，孫黎，
申請(專利權)人：中國科學院海洋研究所，
類型：發明
國別省市：
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