本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種反膠團(tuán)法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其特征是包括如下步驟：制備鰱魚魚精蛋白粗提液，進(jìn)行微濾、超濾，調(diào)整濾液pH值和離子強(qiáng)度，配制反膠團(tuán)溶液和反萃取水相溶液，萃取和反萃取步驟，通過改進(jìn)反膠團(tuán)法中反膠團(tuán)體系的配比、萃取水相中離子種類和離子強(qiáng)度、pH值、反萃取溫度以及在反萃取水相中附加物質(zhì)，提高了反膠團(tuán)法的純化效率，使得鰱魚魚精蛋白的酶活回收率高于98.5%，純化因子達(dá)到3，克服了現(xiàn)有技術(shù)中反膠團(tuán)萃取魚精蛋白酶活回收率和純化因子不高的缺陷。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物活性物質(zhì)分離純化
，尤其涉及一種利用反膠團(tuán)法分離萃取魚精蛋白的方法以及萃取工藝的優(yōu)化改進(jìn)。
技術(shù)介紹
魚精蛋白又稱精蛋白(Protamine)是一種多聚陽離子天然肽類，是一種存在于魚 類成熟精巢中的堿性蛋白，與DNA以非共價(jià)鍵緊密結(jié)合在一起，以核精蛋白的形式存在。魚精蛋白是一種小而簡單的球形堿性蛋白質(zhì)，其分子量較小，從幾千到一萬多道爾頓。一般由30個(gè)左右氨基酸組成，其中2/3以上是精氨酸。它能溶于水或稀酸中，不易溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，穩(wěn)定性好，加熱不凝固，熱穩(wěn)定性較好，120°C 30min也能維持活性，等電點(diǎn)在10 — 12之間，帶正電荷。根據(jù)堿性氨基酸組成的種類和數(shù)量的不同，可將魚精蛋白分為單魚精蛋白、雙魚精蛋白和三魚精蛋白。其中，單魚精蛋白僅含一種組分精氨酸，如鮭、鯡和虹鱒精蛋白等；雙魚精蛋白含有精氨酸、組氨酸或賴氨酸，如鯉精蛋白；三魚精蛋白含有三種堿性氨基酸，如鰱、鱘精蛋白。研究表明常見的魚精蛋白并不是單一組分，通常是由幾種相互非常類似的組分組成的混合物。魚精蛋白在魚類精巢中的含量極不穩(wěn)定，隨性腺的成熟度而變化很大。魚精蛋白存在于雄性個(gè)體的精巢組織中，是在精子成熟過程中代替組氨酸的。從研究報(bào)道的資料看，各國對(duì)魚精蛋白的研究，多以鮭魚為對(duì)象。目前，我國學(xué)者已經(jīng)成功的從鯪魚、羅非魚、鰱魚、鯉魚等淡水魚精巢中提取了魚精蛋白。魚精蛋白的提取基本上以硫酸或鹽酸為主要提取劑，以檸檬酸或有機(jī)溶劑為純化劑，其獲得的是魚精蛋白粗品，還含有其他物質(zhì)如核酸、雜蛋白等，需要進(jìn)一步純化，一般采用葡聚糖凝膠柱層析法純化，再利用等電聚焦電泳和生物質(zhì)譜的方法對(duì)其等電點(diǎn)和分子量進(jìn)一步測定。傳統(tǒng)的魚精蛋白分離純化工藝都比較復(fù)雜，純化周期也較長，有待于新的純化工藝的使用。反膠團(tuán)萃取是近年發(fā)展起來的分離和純化生物物質(zhì)的新方法。反膠團(tuán)是表面活性劑溶于有機(jī)溶劑中形成的納米級(jí)聚集體，是一種透明、穩(wěn)定的熱力學(xué)體系。反膠團(tuán)中表面活性劑非極性尾基向外與有機(jī)溶劑接觸，極性頭基向內(nèi)形成極性核，極性核溶入水后形成微“水池”，當(dāng)反膠團(tuán)與含蛋白質(zhì)的水相接觸時(shí)，蛋白質(zhì)在表面活性劑核蛋白質(zhì)所帶電荷間的靜電相互作用以及疏水作用等作用力下進(jìn)入微“水池”中，使蛋白質(zhì)避免和有機(jī)溶劑接觸，不致失活。反膠團(tuán)萃取蛋白質(zhì)技術(shù)包含兩個(gè)過程一個(gè)過程是蛋白質(zhì)從水相轉(zhuǎn)移到反膠團(tuán)中(正萃取過程)，第二個(gè)過程是目標(biāo)蛋白質(zhì)從反膠團(tuán)相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的水相(反萃取過程)，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離與純化。反膠團(tuán)萃取具有選擇性高、萃取過程簡單，且正向萃取和反向萃取可同時(shí)進(jìn)行，并能有效防止大分子失活、變性等優(yōu)良特性，因此，在制藥、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、化工等領(lǐng)域等到了極大的研究和應(yīng)用。專利ZL200810079320. 5利用反膠團(tuán)法直接從魚精蛋白粗體液中分離純化出魚精蛋白，克服了目前純化工藝復(fù)雜、步驟多、周期長的問題，但是該方法獲得的純化魚精蛋白酶活回收率僅達(dá)到96%，純化因子也只有2.1。鑒于現(xiàn)有的反膠團(tuán)萃取魚精蛋白所存在的酶活回收率、純化因子較低的問題，本申請(qǐng)針對(duì)影響萃取工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)，以提高魚精蛋白的酶活回收率和純化因子。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是在于需要提供一種反膠團(tuán)法分離萃取魚精蛋白的方法，并對(duì)其蛋白提取、前萃取和反萃取工藝進(jìn)行改進(jìn)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中存在的酶回收率和純化因子低的問題。本專利技術(shù)所述的反膠團(tuán)法是利用表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑中超過一定濃度后自發(fā)形成的一種親水性基團(tuán)向內(nèi)、內(nèi)含微小水滴的納米級(jí)集合性膠體實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的分離萃取。 為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了一種反膠團(tuán)法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，具體步驟如下第一步制備鰱魚魚精蛋白粗提液，第二步進(jìn)行微濾、超濾，第三步調(diào)整濾液PH值和離子強(qiáng)度，第四步配制反膠團(tuán)溶液和反萃取水相溶液，第五步經(jīng)萃取和反萃取步驟獲得酶活回收率高于98. 5%的魚精蛋白純品。其中，所述鰱魚魚精蛋白粗體液的制備方法為取2400g鰱魚魚白組織勻漿，加入IN H2SO4于20°C抽提lh，然后5100g離心30min，收集上清液加入濃度為30%的NaOH調(diào)節(jié)pH值為8. 5，繼續(xù)5100g離心30min，收集的上清即為魚精蛋白粗提液。其中，所述微濾、超濾步驟為將收集的上清液加入IN HCl置于(TC過夜處理，進(jìn)行真空抽濾(Whatman # 2)，收集上清，再使用Millipore TFF IOKDa NMWL進(jìn)行超濾處理。其中，所述超濾液用O. 2mol/L Na2HPO4-NaOH緩沖液調(diào)節(jié)pH值為8. 5，使用2 mol/LKCl調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度為O. 15 mol。其中，所述反膠團(tuán)溶液的配制方法為，將表面活性劑二 - (2 —乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)和聚氧乙烯基壬基酚醚(0PE4)按6:4的配比加入正己烷中，并添加4%正丁醇作為助溶劑，用含I mol/LKCl的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，即得透明澄清的反膠團(tuán)溶液。其中，所述反萃取水相的配制方法為，配置含有I m0l/LKCl、15%異丙醇的反萃取水相溶液，添加正戊醇和蔗糖，使其濃度分別為3%和O. 75mol/L。其中，所述萃取步驟為將調(diào)節(jié)過pH值和離子強(qiáng)度的魚精蛋白粗體液與反膠團(tuán)溶液以重量份1:1加入到三角瓶中，振蕩IOmin, 8000rpm/min離心5分鐘,使兩相分離。其中所述反萃取步驟為將負(fù)載魚精蛋白的反膠團(tuán)溶液與反萃取水溶液以1:1體積混合，45°C下振蕩IOmin,8000rpm/min離心5分鐘,使兩相分離,水相中即含所提純的魚精蛋白。有益效果通過上述步驟，獲得酶活回收率高于98. 5%，純化因子為3的鰱魚魚精蛋白純品。本專利技術(shù)在已有的反膠團(tuán)法提取魚精蛋白萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上，改良萃取工藝通過控制反膠團(tuán)中表面活性劑的比例、PH值、離子強(qiáng)度、反萃取溫度以及添加適當(dāng)?shù)闹軇┖吞岣呙富钚缘幕瘜W(xué)組分，達(dá)到高效萃取酶活蛋白的目的。同已有的反膠團(tuán)法相比，它具有純化率高，酶活性保留好等特點(diǎn)。附圖說明圖1表示pH為8. 5條件下魚精蛋白萃取率和反膠團(tuán)含水率隨KCl和NaCl變化的情況； 圖2表示水相pH值對(duì)魚精蛋白萃取率的影響； 圖3表示溫度對(duì)反萃取率和酶活回收率的影響。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)提供了一種反膠團(tuán)法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，具體步驟如下第一步制備鰱魚魚精蛋白粗提液，第二步進(jìn)行微濾、超濾，第三步調(diào)整濾液pH值和離子強(qiáng)度，第四步配制反膠團(tuán)溶液和反萃取水相溶液，第五步經(jīng)萃取和反萃取步驟獲得酶活回收率高于98. 5%的魚精蛋白純品。所述鰱魚魚精蛋白粗體液的制備方法為取2400g鰱魚魚白組織勻楽,加入IN H2SO4于20°C抽提lh，然后5100g離心30min，收集上清液加入濃度為30%的NaOH調(diào)節(jié)pH值為8. 5，繼續(xù)5100g離心30min，收集的上清即為魚精蛋白粗提液。所述微濾、超濾步驟為將收集的上清液加入IN HCl置于0°C過夜處理，進(jìn)行真空抽濾(Whatman # 2)，收集上清，再使用Millipore TFF IOKDa NMWL進(jìn)行超濾處理。所述超濾液用O. 2mol/L Na2HPO4-NaOH緩沖液調(diào)節(jié)pH值為8. 5，使用2 mol/LKCl調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度為O. 15 mol。所述反膠團(tuán)溶液的配制方法為，將表面活本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種反膠團(tuán)法分離萃取鰱魚魚精蛋白的方法，其特征是包括如下步驟：制備鰱魚魚精蛋白粗提液，進(jìn)行微濾、超濾，調(diào)整濾液pH值和離子強(qiáng)度，配制反膠團(tuán)溶液和反萃取水相溶液，經(jīng)萃取和反萃取步驟獲得酶活回收率高于98.5%的魚精蛋白純品。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張永勤，張春革，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：青島亞博生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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