表征和多維展示蛋白質(zhì)折疊過程的新方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種新的工藝方法，用以表征和多維演示蛋白質(zhì)的折疊卷曲過程(圖9)，是一種方法上的新組合，包含有對(duì)蛋白質(zhì)在其折疊過程中進(jìn)行化學(xué)修飾并對(duì)其形成的水合折疊中間體進(jìn)行分子大小的動(dòng)態(tài)排列、對(duì)蛋白質(zhì)折疊中間體的酶解片斷依據(jù)生物信息學(xué)識(shí)別模板進(jìn)行歸類、對(duì)蛋白質(zhì)折疊中間體進(jìn)行折疊途徑歸屬關(guān)系的分類和由此對(duì)蛋白質(zhì)折疊過程做出的表征以及對(duì)表征結(jié)果的電腦輔助多維可視化。此工藝方法的特殊性在于，所有在折疊過程中通過化學(xué)修飾捕捉到的不同構(gòu)象的蛋白質(zhì)折疊中間體，采用其各自擁有的4個(gè)特性，即其水合動(dòng)力學(xué)分子大小、其形成時(shí)間點(diǎn)、其歸屬的折疊路徑以及其形成量的多少來辨別和數(shù)字化描繪。此工藝可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)疾病的研究，蛋白質(zhì)工程、抗體工程、分子生物學(xué)、治療醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、蛋白質(zhì)生物藥品的生產(chǎn)、蛋白分類學(xué)以及制造蛋白質(zhì)新功能材料的納米技術(shù)。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及制造和使用各種不同類型的產(chǎn)品，用以該工藝方法的實(shí)際操作執(zhí)行，如不同的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)試劑盒、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，軟件和自動(dòng)裝置。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及的應(yīng)用領(lǐng)域包含蛋白質(zhì)折疊及其途徑的研究，蛋白質(zhì)工程，抗體工程，分子生物學(xué)，免疫生物學(xué)，治療性藥物，生物技術(shù)，生物技術(shù)蛋白藥物產(chǎn)品，蛋白質(zhì)分類學(xué)，和用以開發(fā)新型功能性蛋白質(zhì)材料的納米技術(shù)。
技術(shù)介紹
蛋白質(zhì)必須正確折疊才能夠?qū)崿F(xiàn)其生物學(xué)功能。其線性多肽鏈在核糖體上合成后需被轉(zhuǎn)運(yùn)到其他部位形成適當(dāng)?shù)亩?jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊會(huì)引發(fā)許多疾病，如肌肉萎縮性疾病，老年癡呆癥(Alzheimer’ sdisease)，皮質(zhì)紋狀體脊髓變性綜合癥(the Creutzfeld Jakob disease),羊瘙庫癥和瘋牛病(Bovine spongiformeEnzephalopathie BSE)。研究專利技術(shù)一種行之有效的工藝方法用來解釋蛋白質(zhì)的折疊機(jī)制，說明疾病的成因繼而開發(fā)新型的治療藥物，至今仍是生命科學(xué)界一項(xiàng)重大的挑戰(zhàn)。安芬森(Christian Anfinsen, 1972,諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))關(guān)于蛋白質(zhì)復(fù)性的實(shí)驗(yàn)使人們知道,蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)含有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的全部信息。然而他仍無法解釋蛋白質(zhì)如何折疊以及如何找到它們的天然構(gòu)象。近幾十年來，世界各國的科學(xué)家都非常重視尋找解決“蛋白質(zhì)折疊難題”的方法。近年來，一些用來檢測(cè)，解釋和特征性描述蛋白質(zhì)折疊的理論和方法及技術(shù)得到相應(yīng)的發(fā)展。1.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可用于幫助解釋其折疊機(jī)制，到目前為止有兩種已知的適用方法。第一種是以氨基酸序列為參照的方法，也就是同源建模(Guex，1997年；Schwede，2003年；Kopp，2004 年)和串線算法(Hendlich，1990 年;Sippl, 1996 ^ ;Madej，1995 年)。這個(gè)方法基于一些蛋白質(zhì)具有相似的氨基酸序列的特性。一個(gè)未知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的序列與已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的序列進(jìn)行比較，如果序列的相似性被確定，已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)可被作為未知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模板。到目前為止這是唯一的一個(gè)實(shí)用方法，用于同源蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的研究。第二種是從頭計(jì)算預(yù)測(cè)法(Karplus, 1990; Sippl, 1995; Shortle, 1997)，在此方法中氨基酸鏈的折疊不用參考其他已知蛋白的結(jié)構(gòu)就能被預(yù)測(cè)。借助于計(jì)算機(jī)，通過計(jì)算未知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子能量最小化也可模擬折疊過程。為達(dá)到這個(gè)目標(biāo)，1994年舉行了全球蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)競(jìng)賽 CASP (the Critical Assessment of Techniques for proteinStructure Prediction) (www.predictioncenter.0rg)每?jī)赡昱e行一次。在這個(gè)競(jìng)賽中，先公開一些待預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，這些蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)正在被測(cè)定并即將公布，參賽者將自己對(duì)這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果與公布的結(jié)果相比較，檢驗(yàn)預(yù)測(cè)效果，推測(cè)其折疊機(jī)制。2.蛋白質(zhì)折疊的經(jīng)典模型以前，蛋白質(zhì)折疊方面的研究主要以觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果為主，建立起了許多模型。其中最簡(jiǎn)單的是雙態(tài)模型(Two-State Model)。大多數(shù)的模型都認(rèn)為折疊是一個(gè)分步過程。這些模型共同之處是對(duì)蛋白質(zhì)折疊機(jī)理解釋的局限性，一般只適用于各自用以研究的模型蛋白質(zhì)?？傮w來說，認(rèn)為蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與疏水性塌陷在折疊初期就已形成。微小結(jié)構(gòu)域和拼圖折疊模型(jigsaw puzzles model)及溶融球態(tài)模型(Ohgushi M&ffada A, 1983)也解釋了一些蛋白質(zhì)的折疊過程。雙態(tài)模型(Two-state Model)是關(guān)于一些小蛋白質(zhì)折疊的最簡(jiǎn)單的模型，在這個(gè)模型中只存在兩種穩(wěn)定狀態(tài):折疊或未折疊。序變模型表明折疊過程由未折疊到折疊要經(jīng)過中間產(chǎn)物階段。Tsong等人(Tsong et al)認(rèn)為,可用折疊過程形成的系列中間產(chǎn)物來定義折疊的途徑(Tsong et al.，1972)?？蚣苣Ｐ?Kim and Baldwin, 1990)認(rèn)為，折疊時(shí)，局部獨(dú)立的單個(gè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元先形成，然后這些單元彼此擴(kuò)延相連形成三級(jí)結(jié)構(gòu)。與之相反的是建立在以折疊核形成為基礎(chǔ)的成核模型(Wetlaufer, 1973),他認(rèn)為蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)由折疊核誘發(fā)形成。疏水塌陷模型(Dill ef al.，1995)假設(shè)，蛋白質(zhì)肽鏈在開始折疊時(shí)，由于氨基酸側(cè)鏈的疏水相互作用，使其在不同的肽鏈部位首先發(fā)生收縮，然后經(jīng)過局部構(gòu)象的重整形成其天然結(jié)構(gòu)。微小結(jié)構(gòu)域折疊模型認(rèn)為，蛋白質(zhì)折疊時(shí)，微小結(jié)構(gòu)子域的天然構(gòu)象首先形成，然后這些結(jié)構(gòu)域經(jīng)過擴(kuò)延或與其他子結(jié)構(gòu)域的碰撞形成蛋白質(zhì)的完整天然結(jié)構(gòu)。拼圖模型像其他模型一樣，認(rèn)為蛋白質(zhì)折疊可形成唯一的天然結(jié)構(gòu)，不過像拼圖一樣，可經(jīng)過多種不同的途徑而來完成。熔球態(tài)假說認(rèn)為，熔球狀折疊中間產(chǎn)物會(huì)出現(xiàn)在所有蛋白質(zhì)的折疊過程中。這種折疊中間產(chǎn)物具有完全折疊復(fù)性蛋白質(zhì)所含有的所有二級(jí)結(jié)構(gòu)，但其三級(jí)結(jié)構(gòu)尚未完全形成。所有折疊模型認(rèn)為，在折疊之初，二級(jí)結(jié)構(gòu)單元(a-helices andβ-sheets)都會(huì)在納秒至秒的極短的時(shí)間內(nèi)形成。蛋白質(zhì)的進(jìn)一步折疊，要經(jīng)過二級(jí)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)延、碰撞和由此引發(fā)的體積收縮，最終形成蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)。這個(gè)過程相對(duì)不同的蛋白質(zhì)，需要幾毫秒到幾天的時(shí)間。3.蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)模型安芬森(Christian Anfinsen)和其他研究者所做的實(shí)驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象處于熱力學(xué)的穩(wěn)定狀態(tài)，因此具有最低的吉布斯自由能。列文托(Levinthal, 1968)認(rèn)為，在適當(dāng)?shù)臈l件下蛋白質(zhì)折疊會(huì)沿著特定的折疊途徑(加(folding pathway))進(jìn)行,先形成一系列結(jié)構(gòu)(中間態(tài))，直到達(dá)到具有最低能級(jí)的天然結(jié)構(gòu)。統(tǒng)計(jì)力學(xué)的模型則認(rèn)為，這種連續(xù)折疊的理念可用能量漏斗模型理論(Schultz, 2000)來取代。蛋白質(zhì)折疊的能量漏斗理論將所有可能的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)自由能(縱軸)作為構(gòu)象自由度的函數(shù)(橫軸)來表示。由此想象，尚未折疊且構(gòu)象各異的肽鏈狀蛋白質(zhì)涌入漏斗狀折疊通道中，通道擁有很多不同的局域能量極小值，它們相對(duì)于擁有最小能量的天然態(tài)蛋白質(zhì)，位于能量的中間階段(中間體)。正在折疊卷曲中的蛋白質(zhì)肽鏈可以在里面找到相應(yīng)位置，從而形成折疊中間體。一部分中間體已經(jīng)是相對(duì)穩(wěn)定的緊湊結(jié)構(gòu)“熔球體”，它阻止蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊。大多數(shù)蛋白質(zhì)分子依照漏斗模型沿各自路徑達(dá)到最終折疊狀態(tài)，折疊時(shí)并非沿光滑的漏斗斜面滑下，可能會(huì)遇到各種障礙，經(jīng)歷不同的途徑，直到完全復(fù)性。4.蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)蛋白質(zhì)折疊需要一個(gè)過程，通常經(jīng)歷快速和慢速階段。在快速階段，蛋白質(zhì)肽鏈經(jīng)歷疏水折攏，形成氫鍵和二級(jí)結(jié)構(gòu)單元。這些過程在毫微秒與微秒時(shí)間內(nèi)完成。緩慢的階段則需要在幾秒鐘甚至幾小時(shí)內(nèi)完成。緩慢的折疊過程以核糖核酸酶Akibonuclease A)或硫氧化還原蛋白為例，而較快的折疊過程以溶菌酶和細(xì)胞色素C為例。僅有極少數(shù)蛋白質(zhì)沒有緩慢折疊階段。大的蛋白質(zhì)原則上折疊較慢，在細(xì)胞中折疊時(shí)要由兩類附加蛋白質(zhì)輔助完成。這兩種輔助蛋白分別稱作折疊酶和分子伴侶。折疊酶如PPI肽酰輔氨酰順反異構(gòu)酶(peptidylprolyl c/s-transisomerase位于外周胞質(zhì))，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶PDI和DsbA, B, C, D, G (Protein Disulfide 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2010.07.05 DE 1020100260941.征和多維展示蛋白質(zhì)折疊過程的新方法，其特征在于，對(duì)所有在折疊過程中以不同時(shí)間間隔通過化學(xué)修飾捕捉到的具有不同構(gòu)象的蛋白質(zhì)折疊中間體可以至少根據(jù)其各自擁有的4個(gè)特性，即其水合動(dòng)力學(xué)分子大小、其形成時(shí)間點(diǎn)、其歸屬的折疊路徑以及其形成的量的多少來進(jìn)行鑒別和數(shù)字化描繪，被表征的蛋白質(zhì)折疊過程可由4個(gè)階段組成。該方法適用于對(duì)所有蛋白質(zhì)折疊途徑的特征描述，包括以下步驟: 1)基于對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和有可能的多維結(jié)構(gòu)特征以及蛋白質(zhì)的生物和理化性質(zhì)分析，制作相應(yīng)的理論片段質(zhì)量識(shí)別模板，確定進(jìn)一步的操作方法和實(shí)施方式； 2)通過蛋白質(zhì)變性、還原、必要時(shí)去除還原劑、色譜分離和波譜檢測(cè)，制備完全變性去折疊具有最大水合動(dòng)力學(xué)分子大小的蛋白質(zhì)樣品； 3)對(duì)折疊過程中和可能同時(shí)被氧化的蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)修飾，其中，所有在不同時(shí)間間隔產(chǎn)生的折疊中間體被按序取出，根據(jù)它們被修飾氨基酸殘基的特性，使用相應(yīng)的側(cè)鏈修飾試劑，不同程度的進(jìn)行修飾，使之形成各自相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和各自獨(dú)有的特性，即水合動(dòng)力學(xué)分子大小、形成時(shí)間點(diǎn)、歸屬的折疊路徑以及量化值； 4)分離和量化中間體并展示他們的水合動(dòng)力學(xué)分子大小和必要時(shí)它們的量化值對(duì)應(yīng)于它們形成時(shí)間的函數(shù)關(guān)系，其中，所有在折疊過程中被修飾的中間體可用電泳法或用與波譜檢測(cè)偶合(首選使用動(dòng)態(tài)光散射)的色譜法進(jìn)行分離、量化、數(shù)字化儲(chǔ)存、以備后用，同時(shí)多維展示它們水合動(dòng)力學(xué)分子大小與形成時(shí)間的函數(shù)關(guān)系，形成蛋白質(zhì)折疊過程的指紋圖譜； 5)中間體的片段化，其中，為了鑒別區(qū)分中間體，對(duì)在不同時(shí)間間隔形成、被修飾、分離和其水合動(dòng)力學(xué)分子大小已得以區(qū)分的折疊中間體進(jìn)行酶解片段化，首選使用胰蛋白酶，必要時(shí)可用其它內(nèi)切酶、外肽酶以及化學(xué)方法； 6)中間體片段的檢測(cè)，其中，使用各類質(zhì)譜對(duì)所有單個(gè)片段的分子量以及由二硫鍵和/或交聯(lián)劑結(jié)合的中間體大片段的分子量，進(jìn)行精確測(cè)量，數(shù)據(jù)儲(chǔ)存入庫并分類制成折疊中間體片段質(zhì)量識(shí)別檢測(cè)表； 7)中間體折疊路徑歸屬性的確定，其中，通過對(duì)用質(zhì)譜法整理的片段數(shù)量和質(zhì)量與理論片段質(zhì)量識(shí)別模板參照比較可以確定每個(gè)中間體發(fā)生修飾的類型、數(shù)量和位置作為各自的特征，并鑒于這些個(gè)性特征將中間體按照它們的共同之處劃類歸組，賦予其組分歸屬性，歸屬性相同的中間體給定一個(gè)特定的折疊路徑，也即可由一個(gè)中間體的組歸屬性確定其折疊路徑的歸屬，對(duì)此可進(jìn)一步用蛋白質(zhì)進(jìn)化理論和蛋白質(zhì)折疊動(dòng)力學(xué)理論來補(bǔ)充和完善。8)中間體的鑒定和分類，其中，每一個(gè)中間體都可以至少用它們被測(cè)定的水動(dòng)力學(xué)尺寸大小、形成時(shí)間、數(shù)量、折疊路徑來標(biāo)記和區(qū)分鑒定。根據(jù)它們的特征的一致性，所有被鑒定的中間體可以被分為若干小組，并以此劃歸不同折疊途徑。被歸類于某個(gè)折疊途徑的中間體還可以滿足三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，即它們具有相同的修飾類型，它們的水合動(dòng)力學(xué)分子大小逐漸減小，它們沿著折疊路徑形成的時(shí)序明確； 9)折疊過程的表征，其中，通過在多維坐標(biāo)系里并行標(biāo)記所有被鑒定的在不同折疊路徑上的中間體可以直接確定天然折疊的主導(dǎo)路徑，最快和最慢折疊的路徑，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的路徑，所有折疊路徑的折疊動(dòng)力學(xué)，二硫鍵形成和/或交聯(lián)形成的次序，折疊結(jié)節(jié)的形成，分子重排和折疊路徑的分 支、延伸、交叉、穿越和交匯以及與此相關(guān)的中間體等等，蛋白質(zhì)的折疊過程由此得以表征；10)蛋白質(zhì)折疊過程的圖形和可視化展示，其中，已表征的蛋白質(zhì)折疊過程可以通過定義坐標(biāo)借助計(jì)算機(jī)圖形學(xué)的方法在多維坐標(biāo)系中以多種形式包括動(dòng)畫可視化展示，還可通過重新組合和轉(zhuǎn)換融合所定義的坐標(biāo)擴(kuò)展可視化展示的多樣性。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟3)至少使用一種下列的實(shí)施方式， -對(duì)含有二硫鍵蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)修飾， -對(duì)不含二硫鍵蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)修飾 -對(duì)多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)修飾 -對(duì)體外模擬共翻譯和翻譯后的動(dòng)態(tài)修飾 -對(duì)體外模擬蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)態(tài)修飾 -對(duì)蛋白質(zhì)生物合成的體外動(dòng)態(tài)修飾 和至少一種下列的操作方法， -單項(xiàng)修飾，其中，選擇性地只針對(duì)一種氨基酸的殘基使用一種特異性側(cè)鏈反應(yīng)試劑在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行的修飾化學(xué)反應(yīng)； -多項(xiàng)修飾，其中，選擇性地對(duì)一種或多于一種氨基酸的殘基使用一種或多于一種側(cè)鏈反應(yīng)試劑在不同的反應(yīng)條件下進(jìn)行的修飾化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)可以單獨(dú)進(jìn)行也可分別進(jìn)行后混合； -分子內(nèi)交聯(lián)修飾，其中，選擇性地使用雙端功能側(cè)鏈反應(yīng)試劑在不同的反應(yīng)條件下以不同的實(shí)施方式進(jìn)行的雙重修飾化學(xué)反應(yīng)； 和至少滿足一種下列的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)， -修飾反應(yīng)速率的時(shí)間尺度范圍從納秒、微秒到毫秒，包括氫鍵的形成、二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的形成、肽鏈的疏水折攏； -修飾反應(yīng)速率的時(shí)間尺度范圍從毫秒到分鐘，涉及到快速折疊階段和形成折疊路徑早期中間體的階段； -修飾反應(yīng)速率的時(shí)間尺度范圍從毫秒到數(shù)分鐘，適用于研究以秒至數(shù)小時(shí)或數(shù)日的速率折疊的蛋白質(zhì)，大多涉及到緩慢折疊階段，其間，繼續(xù)產(chǎn)生歸屬不同折疊路徑的中間體，出現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的溶球態(tài)緊密結(jié)構(gòu)，所有中間體持續(xù)折疊，直到重新折疊到他的原始天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)，并達(dá)到最低能量狀態(tài)。和至少使用一種下列化學(xué)試劑藥品， -蛋白質(zhì)的變性劑， -蛋白質(zhì)二硫鍵的還原劑， -蛋白質(zhì)的氧化劑，包括與它們相配的組合物及變量組份，主要用以修飾含有二硫鍵的蛋白質(zhì)， -含有或不含有同位素標(biāo)記的有效特異性側(cè)鏈基團(tuán)修飾試劑， -含有突光和電子自旋標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)的修飾劑和其它標(biāo)記修飾試劑， -用以分子內(nèi)標(biāo)記的零長度直接交聯(lián)劑、雙端同源功能交聯(lián)劑、雙端異源功能交聯(lián)劑、光敏標(biāo)記修飾試劑， -生物素標(biāo)記試劑， -試劑和/或酶用來蛋白質(zhì)共翻譯或翻譯后的修飾， -各類細(xì)胞提取物，-折疊酶和/或者伴侶蛋白， -折疊酶和/或伴侶蛋白的備選抑制劑， -影響蛋白質(zhì)折疊和降解的化學(xué)和生物性備選活性物質(zhì)， -影響蛋白質(zhì)體外共翻譯修飾的化學(xué)和生物性備選活性物質(zhì)， -影響蛋白質(zhì)體外翻譯后修飾的化學(xué)和生物性備選活性物質(zhì)， -影響蛋白質(zhì)體外生物合成的化學(xué)和生物性備選活性物質(zhì)， -蛋白質(zhì)折疊的輔助及穩(wěn)定劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟4)可以手工進(jìn)行也可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和設(shè)計(jì)自動(dòng)化和微型化進(jìn)行，并采用至少一種下列操作形式， -優(yōu)先使用針對(duì)球形親水蛋白質(zhì)的聚丙烯凝膠電泳，使用至少一種下列的改進(jìn)措施， -連接一個(gè)可以在電泳過程中控制電泳緩沖液濃度、組成、PH值的輸送系統(tǒng)，它可以通過在緩沖液儲(chǔ)缸的陰極端連接一個(gè)充滿所需緩沖液并有滲透性元件的容器裝置來實(shí)現(xiàn)，也可以通過在緩沖液的陰極端配裝一個(gè)用細(xì)管與外面盛有所需緩沖液容器相連接的溶液分配器來實(shí)現(xiàn)。這可使所需的緩沖液根據(jù)需要的速度連續(xù)或不連續(xù)的且按需定量的輸入電泳系統(tǒng)； -通過在電泳過程中對(duì)緩沖溶液的輸入調(diào)節(jié)來動(dòng)態(tài)控制和優(yōu)化折疊中間體的分離分辨率和清晰度。由此可行的對(duì)緩沖液的濃度、組成、PH值的動(dòng)態(tài)調(diào)整和設(shè)定提高了蛋白質(zhì)折疊中間體之間的電荷、極性以及離子流的差異。在這里提高的分離分辨力不再僅僅基于蛋白質(zhì)分子本身的電荷分布和構(gòu)型形式，還取決于那些由此新引入的辨別因子，即動(dòng)態(tài)改變的折疊中間體的表面電荷和極性分布，以及它們與額外離子流不同的相互作用； -應(yīng)用脈沖驅(qū)動(dòng)電泳技術(shù)，通過短時(shí)間提高電壓、短時(shí)間改變緩沖液組份的極性和/或者濃度、短時(shí)間的調(diào)換電泳電極，結(jié)合使用高度疏水的反離子以便聚焦單條泳帶和擴(kuò)增含有折疊中間體泳帶之間的距離； -使用不同成分和性狀的凝膠，比如:對(duì)于較大的蛋白，可以采用孔梯度凝膠來分離。-電泳設(shè)備或者和一個(gè)有效的冷卻恒溫器相連，或者將其和由制冷元件和液體循環(huán)冷卻槽構(gòu)成的裝置組裝在一起，以便凝膠及時(shí)得以散熱，減少折疊中間體由于熱效應(yīng)引起的在凝膠泳帶之間的擴(kuò)散 -和光譜分析儀器，如動(dòng)態(tài)和靜態(tài)散射儀，耦合連接的液相色譜、微型電泳層析柱、微型化的場(chǎng)流分離(FFF)，用以分離區(qū)別它們的水合動(dòng)力學(xué)分子大小。這些儀器適合于分離區(qū)分所有蛋白質(zhì)中間體的水合動(dòng)力學(xué)分子大小，特別是針對(duì)一些不適于電泳分離的蛋白質(zhì)，包括強(qiáng)酸性、強(qiáng)堿性、疏水性的蛋白質(zhì)，還有膜蛋白和非常大的蛋白質(zhì)，其操作形式如下所列。-單級(jí)柱液相色譜，即按照需求與波譜儀器耦合連接的用不同的分離介質(zhì)填裝的微型凝膠色譜柱或者微型場(chǎng)流分離器，用以直接確定每個(gè)分離組份里折疊中間體的水合動(dòng)力學(xué)分子大小的順序； -多級(jí)柱液相色譜，即按照需求對(duì)與光譜測(cè)量方法聯(lián)用的微型分離柱進(jìn)行串聯(lián)和/或并聯(lián)的組合，微型分離柱包括凝膠色譜柱、羥磷灰石柱、疏水柱、離子交換柱、反相色譜柱、親和色譜柱，還有微型場(chǎng)流分離器等，專用于分離一些水合動(dòng)力學(xué)分子大小非常接近和折置路徑的歸屬尚未確定的折置中間體； -波譜學(xué)區(qū)分與量化，即對(duì)分離后分別置于系列小容器或微孔試驗(yàn)板內(nèi)的折疊中間體的水合動(dòng)力學(xué)分子大小進(jìn)行波譜學(xué)鑒別，首選使用動(dòng)態(tài)和靜態(tài)光散射設(shè)備，也使用熒光、紫外/可見光、圓二色法、核磁共振、傅立葉變換紅外、電子自旋共振等技術(shù)； -折疊中間物的特異區(qū)分，即對(duì)單個(gè)分離樣品中的折疊中間物，它們要么具有不同的水合動(dòng)力學(xué)分子大小，要么具有近似的水合動(dòng)力學(xué)分子大小但可能屬于不同的折疊途徑，可以使用本發(fā)明改進(jìn)的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)光散射裝置，它們的區(qū)分能力可以通過以下至少一種方法得以提聞: -通過延長檢測(cè)時(shí)間來提高分辨率， -通過程控升溫的熔點(diǎn)溫度(Tm)區(qū)分， -通過對(duì)樣品用內(nèi)置的真空蒸發(fā)或通風(fēng)濃縮裝置單元進(jìn)行的濃度改變， -通過使用微型自動(dòng)滴定器或手動(dòng)移加所需緩沖液組分...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：韓思梗，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：韓思梗，
類型：
國別省市：