全基因組甲基化高通量測序文庫的構建方法及其應用技術

提供了全基因組甲基化高通量測序文庫的構建方法及其應用。構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法包括：用Msp?I和第二限制性內切酶對基因組DNA進行酶切；將DNA片段進行末端修復；在經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A；將具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連；將具有甲基化接頭的連接產物進行片段選擇，以便獲得目的片段；將目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶；將經過轉換的目的片段進行PCR擴增；分離純化擴增產物，該擴增產物構成全基因組甲基化高通量測序文庫。采用本發明專利技術的構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法及其應用，能夠方便有效地構建基因組DNA樣品的全基因組甲基化高通量測序文庫。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
具體地，涉及全基因組甲基化檢測技術，特別是微量DNA全基因組甲基化檢測
更具體地，本專利技術提供了一種構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法、一種確定基因組DNA樣品的甲基化位點的方法、一種用于確定基因組DNA樣品的甲基化位點的裝置、一組分離的限制性內切酶以及一種用于構建全基因組甲基化高通量測序文庫的試劑盒。
技術介紹
DNA甲基化是研究最為深入的表觀遺傳學機制，DNA甲基化在維持正常細胞功能、抑制寄生DNA成分對基因組完整性的損害、染色質結構修飾、X染色體失活、基因組印跡、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一。然而，目前對全基因組DNA甲基化的研究仍有待改進。
技術實現思路
本專利技術是基于專利技術人的下列發現完成的:減少的代表性重亞硫酸鹽測序(RRBS)(參見Smith ZD等人，2009.在哺乳動物基因組中高通量重亞硫酸鹽測序(High-throughput bisulfite sequencing in mammaliangenomes)Methods.48:226-232.,通過參照將其全文并入本文)，是目前常用的全基因組甲基化檢測方法，其可以檢測人類和 鼠基因組中大部分的CpG島和啟動子區域。然而，越來越多的研究顯示差異甲基化區域(DMRs)如組織特異性差異甲基化區域(T-DMR)和癌癥中的差異甲基化區域(C-DMR)并非僅僅位于CpG島內，更多的甲基化差異區域位于CpG島外，如CpG島外(CGIshores)來調控基因的表達，而這些區域是現有RRBS技術不足以檢測到的。另一方面，現有RRBS技術對島內CG數量的覆蓋度低。本專利技術旨在解決現有技術問題的至少之一。由此，為了檢測基因組中更多具有代表性區域的甲基化狀態并更真實的反應這些區域的甲基化水平，本專利技術提供了全基因組甲基化高通量測序文庫的構建方法及其應用。根據本專利技術的一個方面，本專利技術提供了一種構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法。根據本專利技術的實施例，該方法包括以下步驟:用Msp I和第二限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，以便獲得DNA片段，其中，所述第二限制性內切酶為選自BstN 1、HpyCH4V、Alu I,Hae II1、HpyCH4 II,Apek I,Ban I1、Taqa1、Sph I,Bgl II,BssS I,BamH I 和 KpnI的至少一種；將所述DNA片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的DNA片段；在所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得具有粘性末端A的DNA片段；將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連，以便獲得具有甲基化接頭的連接產物；將所述具有甲基化接頭的連接產物進行片段選擇，以便獲得目的片段；將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，獲得經過轉換的目的片段；將所述經過轉換的目的片段進行PCR擴增，以便獲得擴增產物；以及分離純化所述擴增產物，所述擴增產物構成全基因組甲基化高通量測序文庫。利用根據本專利技術實施例的構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法，能夠有效地構建基因組DNA樣品的全基因組甲基化高通量測序文庫，特別是能夠有效地構建微量樣本的全基因組甲基化高通量測序文庫，從而能夠有效、充分地應用于高通量測序技術，通過對文庫的測序，然后基于對測序結果的數據分析，就能夠有效地獲得全基因組甲基化位點信息，實現對基因組DNA樣品的全基因組甲基化檢測。根據本專利技術的另一方面，本專利技術提供了一種確定基因組DNA樣品的甲基化位點的方法。根據本專利技術的實施例，該方法包括下列步驟:根據前面所述構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法，構建基因組DNA樣品的全基因組甲基化高通量測序文庫；對該全基因組甲基化高通量測序文庫進行測序，以便得到測序結果；以及對測序結果進行數據分析，以便確定基因組DNA樣品的甲基化位點。利用根據本專利技術實施例的確定基因組DNA樣品的甲基化位點的方法，能夠準確地確定基因組DNA樣品的甲基化位點，從而實現對基因組DNA樣品的全基因組甲基化檢測，相對于目前的RRBS技術，本專利技術的確定基因組DNA樣品的甲基化位點的方法，對全基因組的調控區域的覆蓋廣度得到顯著提高，對調控區域內CpG位點的覆蓋量顯著增加。根據本專利技術的再一方面，本專利技術提供了一種用于確定基因組DNA樣品的甲基化位點的裝置。根據本專利技術的實施例，該裝置包括:文庫制備單元，所述文庫制備單元用于制備基因組DNA樣品的全基因組甲基化高通量測序文庫，所述文庫制備單元內設置有Msp I酶以及第二限制性內切酶，其中，所述第二限制性內切酶為選自BstN 1、HpyCH4 V、Alu I,HaeII1、HpyCH4 I1、Apek 1、Ban I1、Taqa 1、Sph 1、Bgl I1、BssS 1、BamH I 和 Kpn I 的至少一種；測序單元，所述測序單元與所述文庫制備單元相連，并且從所述文庫制備單元接收所述基因組DNA樣品的全基因組甲基化高通量測序文庫，以便用于對所述基因組DNA樣品的全基因組甲基化高通量測 序文庫進行測序，獲得測序結果；以及數據分析單元，所述數據分析單元與所述測序單元相連，并且從所述測序單元接收所述測序結果，以便對所述測序結果進行數據分析，確定所述基因組DNA樣品的甲基化位點。利用根據本專利技術實施例的用于確定基因組DNA樣品的甲基化位點的裝置，能夠方便準確地確定基因組DNA樣品的甲基化位點，可以應用于多種針對全基因組甲基化的研究，例如可以用于對人的腫瘤基因抑制基因的甲基化異常的檢測，以便為人類疾病的早期診斷提供有效的途徑。根據本專利技術的又一方面，本專利技術提供了一組分離的限制性內切酶。根據本專利技術的實施例，其由Msp I酶以及第二限制性內切酶構成，其中，所述第二限制性內切酶為選自BstN 1、HpyCH4 V、Alu 1、Hae II1、HpyCH4 I1、Apek 1、Ban I1、Taqa 1、Sph 1、Bgl I1、BssS 1、BamHI和Kpn I的至少一種。根據本專利技術實施例的Msp I酶和第二限制性內切酶構成的組合，能夠有效地對基因組DNA進行酶切，且酶切獲得的DNA片段非常適用于本專利技術的構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法。根據本專利技術的另一方面，本專利技術提供了一種用于構建全基因組甲基化高通量測序文庫的試劑盒。根據本專利技術的實施例，該試劑盒包括:Msp I酶，以及第二限制性內切酶，其中，所述第二限制性內切酶為選自 BstN 1、HpyCH4 V,Alu I,Hae II1、HpyCH4 II,Apek 1、BanI1、Taq a 1、Sph 1、Bgl I1、BssS I>BamH I和Kpn I的至少一種。利用根據本專利技術實施例的用于構建全基因組甲基化高通量測序文庫的試劑盒，能夠方便有效地構建基因組DNA樣品的全基因組甲基化高通量測序文庫。本專利技術的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本專利技術的實踐了解到。附圖說明本專利技術的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1:顯示了根據本專利技術一個實施例的構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法的流程本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法，其特征在于，包括以下步驟：用Msp?I和第二限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，以便獲得DNA片段，其中所述第二限制性內切酶為選自BstN?I、HpyCH4?V、Alu?I、Hae?III、HpyCH4?II、Apek?I、Ban?II、TaqαI、Sph?I、Bgl?II、BssS?I、BamH?I和Kpn?I的至少一種，優選所述第二限制性內切酶為ApekI；將所述DNA片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的DNA片段；在所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得具有粘性末端A的DNA片段；將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連，以便獲得具有甲基化接頭的連接產物；將所述具有甲基化接頭的連接產物進行片段選擇，以便獲得目的片段；將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，獲得經過轉換的目的片段；將所述經過轉換的目的片段進行PCR擴增，以便獲得擴增產物；以及分離純化所述擴增產物，所述擴增產物構成全基因組甲基化高通量測序文庫；其中，任選地，進一步包括從樣本中提取基因組DNA的步驟，優選所述樣本來源于哺乳動物、植物、和微生物的至少一種，更優選所述哺乳動物為人和小鼠的至少一種；任選地，所述基因組DNA為人類全血基因組DNA；任選地，所述基因組DNA的量為150?200ng，優選100ng；任選地，在將所述DNA片段進行末端修復前，進一步包括純化DNA片段的步驟；任選地，將所述DNA片段進行末端修復是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶進行的，其中，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性；任選地，將所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A是利用Klenow(3’?5’exo?)進行的；任選地，所述甲基化接頭中包含標簽；任選地，將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連前，進一步包括對接頭進行甲基化的步驟；任選地，將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連是利用T4?DNA連接酶進行的；任選地，將所述具有甲基化接頭的連接產物進行片段選擇，是通過2％的瓊脂糖凝膠電泳進行的；任選地，所述目的片段的長度為160?420bp；任選地，在將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理之前，將所述目的片段與片段化的λ?DNA混合，優選所述片段化的λ?DNA的量為200ng；任選地，將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理是采用EZ?DNA?Methylation?Gold?KitTM(ZYMO)進行的；任選地，所述PCR擴增使用熱啟動taq?DNA聚合酶；任選地，所述熱啟動taq?DNA聚合酶為r?taq聚合酶；任選地，基于所述目的片段的長度，確定所述PCR擴增的循環數，其中，當所述目的片段的長度為160bp以上，且小于240bp時，所述PCR擴增的循環數為11；當所述目的片段的長度為240bp以上，且小于340bp時，所述PCR擴增的循環數為13；以及當所述目的片段的長度為340bp以上，且420bp以下時，所述PCR擴增的循環數為15；任選地，分離純化所述擴增產物是通過選自磁珠純化、純化柱純化和2％的瓊脂糖凝膠電泳的至少一種進行的，優選通過2％的瓊脂糖凝膠電泳進行。...

【技術特征摘要】
1.一種構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法，其特征在于，包括以下步驟: 用Msp I和第二限制性內切酶對基因組DNA進行酶切，以便獲得DNA片段，其中所述第二限制性內切酶為選自 BstN 1、HpyCH4 V,Alu I, Hae II1、HpyCH4 11 ,Apek I, Ban I1、Taq a Sph 1、Bgl I1、BssS I> BamH I和Kpn I的至少一種，優選所述第二限制性內切酶為 ApekI ； 將所述DNA片段進行末端修復，以便獲得經過末端修復的DNA片段； 在所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A，以便獲得具有粘性末端A的DNA片段； 將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連，以便獲得具有甲基化接頭的連接產物； 將所述具有甲基化接頭的連接產物進行片段選擇，以便獲得目的片段； 將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶，獲得經過轉換的目的片段； 將所述經過轉換的目的片段進行PCR擴增，以便獲得擴增產物；以及 分離純化所述擴增產物，所述擴增產物構成全基因組甲基化高通量測序文庫； 其中， 任選地，進一步包括從樣本中提取基因組DNA的步驟，優選所述樣本來源于哺乳動物、植物、和微生物的至少一種，更優選所述哺乳動物為人和小鼠的至少一種； 任選地，所述基因組DNA為人類全血基因組DNA ； 任選地，所述基因組DNA的量為150-200ng，優選IOOng ； 任選地，在將所述DNA片段進行末端修復前，進一步包括純化DNA片段的步驟； 任選地，將所述DNA片段進行末端修復是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶進行的，其中，所述Klenow片段具有5’ 一 3’聚合酶活性和3’ 一 5’聚合酶活性，但缺少5’ 一 3’外切酶活性； 任選地，將所述經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A是利用Klenow (3，-5’ exo_)進行的； 任選地，所述甲基化接頭中包含標簽； 任選地，將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連前，進一步包括對接頭進行甲基化的步驟； 任選地，將所述具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連是利用T4 DNA連接酶進行的； 任選地，將所述具有甲基化接頭的連接產物進行片段選擇，是通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進行的； 任選地，所述目的片段的長度為160-420bp ； 任選地，在將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理之前，將所述目的片段與片段化的λ -DNA混合，優選所述片段化的λ -DNA的量為200ng ； 任選地，將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理是采用EZ DNA Methylation-GoldKit (ZYMO)進行的； 任選地，所述PCR擴增使用熱啟動taq DN...

【專利技術屬性】
技術研發人員：高飛，王君文，夏渝東，王俊，
申請(專利權)人：深圳華大基因科技有限公司，深圳華大基因研究院，
類型：發明
國別省市：