一種杉木遺傳轉(zhuǎn)化方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種杉木遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括：轉(zhuǎn)化受體的建立，農(nóng)桿菌菌液制備，侵染，脫菌培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)。該杉木遺傳轉(zhuǎn)化方法，以杉木懸浮細(xì)胞系為受體，以GUS基因為報告基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式實(shí)現(xiàn)植株再生，建立起穩(wěn)定高效的杉木遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用本技術(shù)體系，可以以較低成本對杉木進(jìn)行遺傳改良，將基礎(chǔ)理論研究中獲得的抗病、抗逆、木材形成等相關(guān)的基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得具有速生、抗病、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)的優(yōu)質(zhì)杉木品種。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及杉木遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體涉及一種以杉木懸浮細(xì)胞系為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
技術(shù)介紹
杉木是我國特有的用材樹種，是南方各省區(qū)最重要的造林樹種之一。杉木生長快，產(chǎn)量高，性材好，用途多，木材銷路好，其木材是優(yōu)質(zhì)的建筑材，裝飾用材，是我國最重要的商品材樹種。選育出生長速度快、繁殖力高、抗逆性強(qiáng)的杉木優(yōu)株和無性系對林業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的意義。然而針葉樹生長周期長、樹體高大，而且由于長期異交，具有高度的雜合性和大量的遺傳負(fù)荷。因此傳統(tǒng)育種周期長，難以適應(yīng)速生樹木遺傳改良的需要。林木遺傳基因工程是林木生物技術(shù)的前沿領(lǐng)域，它不僅為林木遺傳改良中的種質(zhì)創(chuàng)新開辟了一條新的途徑，同時也是研究基因功能的重要手段。將基因工程與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，可大大縮短林木育種周期，加速育種進(jìn)程。林木基因工程是通過適合的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，導(dǎo)入有用的外源基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行林木遺傳改良或有關(guān)的研究。近年來，林木基因工程取得了較大的進(jìn)展。目前，已有幾百種植物得到遺傳改良，在豐產(chǎn)，抗病，抗寒等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但在針葉樹中卻由于缺乏良好的轉(zhuǎn)化方法和再生系統(tǒng)而受到嚴(yán)重限制。長期以來，人們認(rèn)為根癌農(nóng)桿菌的宿主主要為雙子葉`植物，但自從D.Cleene和D.Ley首次報道根癌農(nóng)桿菌菌株B6也能感染裸子植物受傷組織，并產(chǎn)生冠癭瘤后，許多學(xué)者開始利用根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行裸子植物尤其是針葉樹的基因轉(zhuǎn)化的研究。并且已經(jīng)證明外源基因在部分針葉樹如白云杉、挪威云杉、火炬松及北美黃杉等的細(xì)胞組織中得到表達(dá)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本專利技術(shù)的目的是提供，以杉木懸浮細(xì)胞系為受體，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，以建立穩(wěn)定高效的杉木遺傳轉(zhuǎn)化體系。技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下: ，包括以下步驟: (1)轉(zhuǎn)化受體的建立: 取繼代3周的杉木胚性愈傷組織細(xì)胞，接種到杉木液體培養(yǎng)基中，23°C，85r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)；每7天繼代一次，第三次繼代后3天后即可用于農(nóng)桿菌侵染；其中，杉木液體培養(yǎng)基為 DCR 基本培養(yǎng)基，附加 Vc 10 mg/L, GA 0.1-2 mg/L, ΑΒΑ 2-5 mg/L, CH 0.5g/L，麥芽糖 30 g/L； (2)農(nóng)桿菌菌液制備:活化EHA105菌液，挑取單菌落，再次活化，28°C、220r/min振蕩培液體養(yǎng)至OD6tltl為0.6-0.8，用杉木液體繼代培養(yǎng)基重懸菌體； (3)侵染: 將菌液搖勻，取3mL菌液加到繼代3天的杉木懸浮細(xì)胞中，靜置l_3min后，置于23°C，85r/min的恒溫?fù)u床繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16 36h ； (4)脫菌培養(yǎng): 用無菌水?dāng)?shù)次洗菌，用杉木液體培養(yǎng)基重懸杉木愈傷，將重懸后的杉木愈傷以鋪平板的方式轉(zhuǎn)移到加有頭孢霉素500mg/L的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每皿4-5mL ;并放入23°C恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。每隔21天繼代一次，誘導(dǎo)3(Γ60天；體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2DCR基本培養(yǎng)基，附加 Vc 10 mg/L, GA 2-8 mg/L，肌醇 5 g/L, CH 0.5 g/L, A C2 g/L，麥芽糖 25 g/L,水晶洋菜2.8 g/L ； (5)篩選培養(yǎng): 待杉木子葉胚成熟后，將其挑到加有200 mg/L頭孢霉素的DCR基本培養(yǎng)基上，23°C光照培養(yǎng)。培養(yǎng)21天后，轉(zhuǎn)移到加有100 mg/L頭孢霉素，20 mg/L卡那霉素的DCR基本培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)；每21天繼代一次。步驟(2)中，杉木液體繼代培養(yǎng)基重懸菌體，菌液的0D_為0.5。步驟(4)中，無菌水中含有500mg/L頭孢霉素。 所述的EHA105帶有35S KUS基因和NPT-1I基因。步驟(5 )中，繼代2次后，就可用于移栽。有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的杉木遺傳轉(zhuǎn)化方法，以杉木懸浮細(xì)胞系為受體，以GUS基因為報告基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式實(shí)現(xiàn)植株再生，建立起穩(wěn)定高效的杉木遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用本技術(shù)體系，可以以較低成本對杉木進(jìn)行遺傳改良，將基礎(chǔ)理論研究中獲得的抗病、抗逆、木材形成等相關(guān)的基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得具有速生、抗病、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)的優(yōu)質(zhì)杉木品種。附圖說明圖1是杉木胚性愈傷顯微照片 圖2是杉木成熟子葉胚 圖3是杉木⑶S瞬間表達(dá)檢測圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例中，所使用到的培養(yǎng)基配方如下，未特別列出的，為常規(guī)培養(yǎng)基。以下實(shí)施例中，使用的DCR (Gupta and Durzan medium)基本培養(yǎng)基的構(gòu)成和標(biāo)準(zhǔn)配方為:340 mg/L KNO3, 556 mg/L Ca (NO3) 2.4Η20，400 mg/L NH4NO3,170 mg/L KH2PO4,85mg/L CaCl2.2H20，370 mg/L MgSO4*7H20, 37.3 mg/L Na2_EDTA.H20，27.9 mg/L FeS04.7H20，6.2 mg/L H3BO3,22.3 mg/L MnSO4*4H20,8.6 mg/L ZnS04*7H20,0.25 mg/L Na2MoO4*2H20,0.25mg/L CuS04*5H20, 0.83 mg/L KI, 0.025 mg/L CoCl2,200 mg/L MyO-1nositol, 2.0 mg/LGlycine,1.0 mg/L Thiamine1HCl,0.5 mg/L Nictinic*acid,0.5 mg/L Pyridoxine*HCl。LB 培養(yǎng)基配方:5 g/L Yeast extract, 10 g/L Tryptone, 5 g/L NaCl。實(shí)施例1轉(zhuǎn)化受體的建立。(I)取繼代3周的杉木胚性愈傷組織細(xì)胞約5mL，將其接種到250mL的無菌三角瓶中，并在瓶壁輕輕敲散，目的是使細(xì)胞分散。杉木胚性愈傷組織細(xì)胞的顯微照片如圖1所/Jn ο(2)量取50mL杉木液體培養(yǎng)基加入三角瓶中，將材料置于23°C，85r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。杉木液體培養(yǎng)基為DCR基本培養(yǎng)基，附加10mg/L VC, 0.1 2.0mg/L GA，2 5mg/L ΑΒΑ, 0.5g/L CH，30g/L 麥芽糖。(3)每7天繼代一次，第三次繼代后3天后(即從第4代的第三天開始)即可用于農(nóng)桿菌侵染。植物基因轉(zhuǎn)化過程中的受體系統(tǒng)是指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，建立的能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。目前為止，對植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的研究已經(jīng)進(jìn)行了大量的工作，先后建立了多種有效的受體系統(tǒng)，適應(yīng)于不同轉(zhuǎn)化方法的要求和不同的轉(zhuǎn)化目的。現(xiàn)已建立的受體系統(tǒng)包括愈傷組織再生系統(tǒng)、直接分化再生系統(tǒng)、原生質(zhì)體再生系統(tǒng)、胚狀體再生系統(tǒng)、生殖細(xì)胞再生系統(tǒng)。目前，以植物體胚發(fā)生體系或體胚作為受體系統(tǒng)越來越受到重視。該系統(tǒng)主要有以下特點(diǎn):其一、組成胚狀體的胚性細(xì)胞接受外源DNA能力很強(qiáng)，是理想的基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，而且這些細(xì)胞繁殖量大，同步性好，因此轉(zhuǎn)化率很高；其二、胚狀體個體間遺傳背景一致，無性系變異小，成苗快，數(shù)量多，而且還可以制成人工種子本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種杉木遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）轉(zhuǎn)化受體的建立：取繼代3周的杉木胚性愈傷組織細(xì)胞，接種到杉木液體培養(yǎng)基中，23℃，85r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)；每7天繼代一次，第三次繼代后3天后即可用于農(nóng)桿菌侵染；其中，杉木液體培養(yǎng)基為DCR基本培養(yǎng)基，附加10?mg/L?Vc，0.1?2.0?mg/L?GA，2?5mg/L?ABA，0.5g/L?CH，30g/L麥芽糖；（2）農(nóng)桿菌菌液制備：活化EHA105菌液，挑取單菌落，再次活化，28℃、220r/min振蕩培液體養(yǎng)至OD600為0.6?0.8，用杉木液體繼代培養(yǎng)基重懸菌體；（3）侵染：將菌液搖勻，取3mL菌液加到繼代3天的杉木懸浮細(xì)胞中，靜置1?3min后，置于23℃，85r/min的恒溫?fù)u床繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16~36h；（4）脫菌培養(yǎng)：用無菌水?dāng)?shù)次洗菌，用杉木液體培養(yǎng)基重懸杉木愈傷，將重懸后的杉木愈傷以鋪平板的方式轉(zhuǎn)移到加有頭孢霉素500mg/L的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每皿4?5mL；并放入23℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)；每隔21天繼代一次，誘導(dǎo)30~60天；體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2DCR基本培養(yǎng)基，附加Vc?10?mg/L，GA?2?8?mg/L，肌醇2?10g/L，CH?0.5g/L，AC?2g/L，麥芽糖25g/L，水晶洋菜2.8g/L；（5）篩選培養(yǎng)：待杉木子葉胚成熟后，將其挑到DCR基本培養(yǎng)基上，在23℃下進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加有200mg/L頭孢霉素；21天后轉(zhuǎn)移到加有100mg/L頭孢霉素，20mg/L卡那霉素的DCR基本培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每21天繼代一次。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種杉木遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)轉(zhuǎn)化受體的建立: 取繼代3周的杉木胚性愈傷組織細(xì)胞，接種到杉木液體培養(yǎng)基中，23°C，85r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)；每7天繼代一次，第三次繼代后3天后即可用于農(nóng)桿菌侵染；其中，杉木液體培養(yǎng)基為 DCR 基本培養(yǎng)基，附加 10 mg/L Vc, 0.1-2.0 mg/L GA, 2-5mg/L ΑΒΑ, 0.5g/LCH, 30g/L麥芽糖； (2)農(nóng)桿菌菌液制備: 活化EHA105菌液，挑取單菌落，再次活化，28°C、220r/min振蕩培液體養(yǎng)至OD6tltl為0.6-0.8，用杉木液體繼代培養(yǎng)基重懸菌體； (3)侵染: 將菌液搖勻，取3mL菌液加到繼代3天的杉木懸浮細(xì)胞中，靜置l_3min后，置于23°C，85r/min的恒溫?fù)u床繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16 36h ； (4)脫菌培養(yǎng): 用無菌水?dāng)?shù)次洗菌，用杉木液體培養(yǎng)基重懸杉木愈傷，將重懸后的杉木愈傷以鋪平板的方式轉(zhuǎn)移到加有頭孢霉素500mg/L的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中每皿4-5mL ;并放入2...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：施季森，王丹，陳金慧，周小紅，
申請(專利權(quán))人：南京林業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：