本發明專利技術涉及一種大豆改良胚尖轉化方法。利用農桿菌介導，真空滲透輔助外源基因導入，帶一片子葉的胚尖轉化方法。包括如下步驟：獲得大豆帶一片子葉的外植體，利用農桿菌真空滲透輔助侵染與共培養，轉化得到轉基因大豆。所述大豆的外植體為無菌水浸泡萌發后去掉種皮，一片子葉和原葉的胚尖；所述的侵染方法為真空滲透輔助侵染，0.05MPa壓力5-8分鐘，28℃黑暗環境下150r/min振蕩侵染1h。本發明專利技術提供了利用帶一片子葉的胚尖為受體建立大豆遺傳轉化體系的方法，不經過組織培養階段，可在較短時間內獲得再生植株，用于大豆基因工程的基本操作系統，對于大豆品質改良具有重要的理論和實踐意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種利用農桿菌介導的大豆改良胚尖轉化方法。
技術介紹
大豆「Glycine max (L.)Merr.」原產我國，是重要的經濟作物之一，其營養價值極聞，蛋白質含量可達40%,而且品質好，易溶于水，最易被人體吸收利用，屬全價蛋白，是唯一能代替動物性食品的植物產品。但是大豆產量和品質卻容易受到病、蟲、草害的影響。人們試圖基因工程手段改良大豆，使其抗逆能力增強。但是用于轉基因大豆的再生系統一直是此領域的難點之一。人們對大豆組織培養再生體系的研究可以追朔到20世紀60年代，到80年代才有突破性進展。其再生體系一般可分為兩種，一種是器官發生途徑，另一途徑是體細胞胚的發生。到目前為止，大豆再生體系仍普遍存在再生率低、重復性差、基因型依賴強、培養條件煩瑣等問題，在很大程度上限制了利用基因工程手段對大豆的遺傳改良。因此，建立高效、簡便的再生體系，對大豆生物技術育種取得突破性進展具有重要意義。在大豆植物組織培養研究與再生體系的研究中，先后有人選用胚軸、子葉節、胚尖、幼嫩子葉、原生質、花粉等不同的外植體進行了大豆再生研究，它們均有各自的優缺點。胚軸、子葉節、胚尖再生系統用時短，再生頻率高，操作簡單，不過易形成嵌合體，后期的檢測、鑒定、篩選工作量大。幼嫩子葉、原生質、花粉再生體系，用時長，再生頻率低，轉化困難。2004年Liu等首次報道了利用胚尖再生系統進行農桿菌介導的遺傳轉化，其再生效率高達87.7%，遠高于子葉節再生體系的40.3%和下胚軸再生體系的56.4%。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供。利用農桿菌介導，真空滲透輔助外源基因導入，帶一片子葉的胚尖轉化方法。本方法中帶一片子葉的胚尖經過6-BA預培養誘導后，利用農桿菌真空滲透輔助侵染，共培養后直接轉到營養土中培養即可獲得高頻的再生植株，該方法取材方便，不需要經過組織培養階段，無嚴格的滅菌要求，再生率高、操作簡單、生長周期短，是良好的遺傳轉化受體系統。本專利技術提供包括的步驟:大豆外植體的獲得；農桿菌菌液制備；真空滲透輔助侵染與共培養；轉化外植體再生；移栽、篩選；具體為 (O 大豆外植體的獲得 挑取種皮完整、無病斑且干燥的成熟大豆種子，用氯酸鈉:濃鹽酸=10:1在樂扣杯中制造氯氣，滅菌4-6h，超凈工作臺中通風使氯氣散盡后加適量無菌水，25-28°C黑暗環境中浸泡萌發12-15 h。取吸脹萌動的大豆種子，在無菌濾紙上吸取多余水分，剝去種皮，沿遠種臍端將兩片子葉分開，去掉一片子葉和原葉，保留完整胚和另一片子葉，獲得帶一片子葉的胚尖外植體，將外植體胚尖向上豎直插入預培養基中預培養24 -28h。預培養基:MS + 30g/L蔗糖 + I mg/L 6- BA + 7 g/L 瓊脂，pH 5.8。(2) 農桿菌菌液制備在超凈工作臺中，用無菌移液器從LB培養平板(含卡那霉素50 mg/L壯觀霉素100 mg/L氯霉素25 mg/L)上吸取含有質粒pS0Y12的農桿菌單菌落接種于LB液體培養基中(含卡那霉素50 mg/L壯觀霉素100 mg/L氯霉素25 mg/L), 28°C, 200 r/min振蕩培養過夜，然后以1:10-20進行2次活化，培養至0D600 =1.0左右，將菌液置于滅菌的離心管中，4000r/min 25°C離心IOmin收集菌體，將菌體重懸于液體共培養基，調整0D600 =0.5左右作為工程菌液備用。LB培養基:10 g/L胰蛋白胨+ 5 g/L酵母提取物+ IOg/LNaCl, pH7.0,固體LB培養基另加15 g/L。 (3) 真空滲透輔助侵染與共培養 將預培養24 h已轉綠的外植體從培養基中取出，加入預先制備好的工程菌液，抽真空并維持0.05MPa壓力5-8分鐘，28°C黑暗環境下150 r/min振蕩侵染I h，棄去菌液，將外植體近軸面朝下置于固體共培養培養基中，26-28°C黑暗環境下共培養3 do 16 h /8 h(L/D)的光照條件下培養l-3d。·共培養培養基:MS+ 30 g/L蔗糖+ I mg/L6- BA + 200mol*L —1乙酰丁香酮，pH 5.8，固體共培養培養基另加7 g/L瓊脂。(4) 轉化外植體再生 將外植體從培養基中取出，用無菌水徹底沖洗干凈后種植于穴盤中，營養土:蛭石:珍珠巖=2:2:1，光照培養箱中培養，待長出4-6片葉片后移栽至溫室中生長。(5) 篩選，PCR 檢測 當小苗在土壤中長出4-7片新葉，用除草劑150mg/L草甘膦涂抹葉片，篩選出有抗性的植株。采用CTAB法提取篩選為陽性的植株的基因組DNA，進行目的基因的PCR檢測，目的基因檢測的上下游引物序列分別為:上游:GCTGGCCATCGACGAGTTC，下游:GGCCAGGAAGTTCGGGAAG,序列長328bp(見序列表)。PCR反應體系為I μ L基因組DNA，2.5 μ L10XPCR buffer,2y L dNTPs ( 2.5 μ M )，1.25U LA Taq 酶，加水至25 μ L15PCR 反應程序:94°C:3 min:94°C 30s, 55°C 30 s,72°C 30s，30 個循環；72°C 10 min。本專利技術提供的大豆改良胚尖轉化方法是利用帶一片子葉的胚尖為受體建立大豆遺傳轉化體系的方法，不經過組織培養階段，可直接轉到營養土中培養即可獲得高頻的再生植株，該方法取材方便，不需要經過組織培養階段，無嚴格的滅菌要求，再生率高、操作簡單、生長周期短，是良好的遺傳轉化受體系統，用于大豆基因工程的基本操作系統，對于大豆品質改良具有重要的理論和實踐意義。附圖說明圖1為大豆種子氯氣滅菌。圖2為大豆外植體預培養示意圖。圖3為農桿菌侵染大豆外植體。圖4為大S.外植體與農桿菌共培養。圖5為穴盤中再生的大豆植株。圖6為移栽的大豆植株。圖7為成活的大豆植株。圖8為除草劑150mg/L草甘膦涂抹葉片篩選，a為野生型對照，b可恢復病斑判斷為陽性。圖9為含目的基因EPSPS的pS0Y12質粒圖譜。圖10為吉育91轉EPSPS基因PCR檢測電泳圖。具體實施例方式實施例菌株、質粒:實驗中所用的農桿菌為C58菌株，重組質粒載體為pS0Y12，由浙江大學生命科學學院植物科學研究所壽惠霞教授實驗構建并提供(見中國優秀碩士學位論文全文數據庫，周正劍，抗草甘膦轉基因大豆體系的優化[D].浙江大學，2011 ；CN201110303049.0)，質粒上構建有目的基因EPSPS和標記基因Bar。將保存的C58農桿菌感受態從_80°C冰箱拿出，置于冰上，取出2μ L 50￥12質粒與農桿菌20(^1^混勻，冰浴51^11，放入預冷的電擊杯中，1500V，電擊轉化。將菌液吸入1.5mL EP管中，加入500 μ L YEP培養基，于27°C振蕩暗培養4h，4000r/min, 28°C，離心收集菌體，棄500 μ L上清，重懸菌體，涂板于27°C培養2天，篩選出已轉化的農桿菌菌株。(1)大豆外植體的獲得 以吉育91為受體材料，挑取種皮完整、無病斑且干燥的成熟大豆種子，用氯酸鈉:濃鹽酸=10:1在樂扣杯中制造氯氣，滅菌4-6h，超凈工作臺中通風使氯氣散盡后加適量無菌水，25-28°C黑暗環境中浸泡萌發12-15 h。取吸脹萌動的大豆種子本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種大豆改良胚尖轉化方法，其特征在于：包括如下的步驟：?1）大豆外植體的獲得挑取種皮完整、無病斑且干燥的成熟大豆種子，用氯酸鈉：濃鹽酸=10：1在樂扣杯中制造氯氣，滅菌4?6h，超凈工作臺中通風使氯氣散盡后加適量無菌水，25?28℃黑暗環境中浸泡萌發12?15?h?；取吸脹萌動的大豆種子，在無菌濾紙上吸取多余水分，剝去種皮，沿遠種臍端將兩片子葉分開，去掉一片子葉和原葉，保留完整胚和另一片子葉，?獲得帶一片子葉的胚尖外植體，將外植體胚尖向上豎直插入預培養基中預培養24?28?h；2）農桿菌菌液制備在超凈工作臺中，用無菌移液器從?LB?培養平板(含卡那霉素50?mg/L?壯觀霉素100?mg/L?氯霉素25?mg/L)上吸取含有質粒?pSOY12?的農桿菌單菌落接種于?LB?液體培養基中(含卡那霉素50?mg/L?壯觀霉素100?mg/L?氯霉素25?mg/L)，28℃，200?r/min振蕩培養過夜，然后以1：10?20進行2次活化，培養至?OD600?=?1.?0，將菌液置于滅菌的離心管中，4000r/min?25℃離心10min收集菌體，將菌體重懸于液體共培養基，調整OD600?=?0.?5?左右作為工程菌液備用；???3）真空滲透輔助侵染與共培養將預培養?24?28?h?已轉綠的外植體從培養基中取出，加入預先制備好的工程菌液，抽真空并維持0.05MPa壓力5?8分鐘，25?28℃黑暗環境下150?r/min振蕩侵染1?3?h?，棄去菌液，將外植體近軸面朝下置于固體共培養培養基中，26?28℃黑暗環境下共培養3?d；16?h?/8?h(?L/D)?的光照條件下培養1?3d；?4）轉化外植體再生將外植體從培養基中取出，?用無菌水徹底沖洗干凈后種植于穴盤中，營養土：蛭石：珍珠巖=2：2：1，光照培養箱中培養，待長出4?6?片葉片后移栽至溫室中生長；5）篩選，PCR檢測當小苗在土壤中長出4?7片新葉，用除草劑150mg/L草甘膦涂抹葉片，篩選出有抗性的植株。采用CTAB法提取篩選為陽性的植株的基因組DNA，進行目的基因的PCR檢測，目的基因檢測的上下游引物序列分別為：上游：GCTGGCCATCGACGAGTTC，下游：GGCCAGGAAGTTCGGGAAG；PCR反應體系為1μL基因組DNA，2.5μL?10×PCR?buffer，2μL?dNTPs?(?2.5μM?)，1.25U?LA?Taq?酶，加水至25μL；PCR?反應程序：94℃：3?min：94℃?30s，55℃30?s，72℃30s，30個循環；72℃10?min。...
【技術特征摘要】
2012.04.13 CN 201210107067.61.一種大豆改良胚尖轉化方法，其特征在于:包括如下的步驟: 1)大豆外植體的獲得 挑取種皮完整、無病斑且干燥的成熟大豆種子，用氯酸鈉:濃鹽酸=10:1在樂扣杯中制造氯氣，滅菌4-6h，超凈工作臺中通風使氯氣散盡后加適量無菌水，25-28°C黑暗環境中浸泡萌發12-15 h ； 取吸脹萌動的大豆種子，在無菌濾紙上吸取多余水分，剝去種皮，沿遠種臍端將兩片子葉分開，去掉一片子葉和原葉，保留完整胚和另一片子葉，獲得帶一片子葉的胚尖外植體，將外植體胚尖向上豎直插入預培養基中預培養24-28 h ； 2)農桿菌菌液制備 在超凈工作臺中，用無菌移液器從LB培養平板(含卡那霉素50 mg/L壯觀霉素100mg/L氯霉素25 mg/L)上吸取含有質粒pSOY12的農桿菌單菌落接種于LB液體培養基中(含卡那霉素50 mg/L壯觀霉素100 mg/L氯霉素25 mg/L), 28°C, 200 r/min振蕩培養過夜，然后以1:10-20進行2次活化，培養至0D600 =1.0，將菌液置于滅菌的離心管中，4000r/min 25°C離心IOmin收集菌體，將菌體重懸于液體共培養基，調整0D600 = 0.5左右作為工程菌液備用； 3)真空滲透輔助侵染與共培養 將預培養24-28 h已轉綠的外植體從培養基中取出，加入預先制備好的工程菌液，抽真空并維持0.05MPa壓力5-8分鐘，25_28°C黑暗環境下150 r/min振蕩侵染1-3 h，棄去菌液，將外植體近軸面朝下置于固體共培養培養基中，26-28°C黑暗環境下共培養3 d...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王罡，季靜，馮遠航，王偉，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：
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