一種培育富含花青苷煙草的方法及其應用技術

本發明專利技術提供一種培育富含花青苷煙草的方法。以楊梅果實中已確認的可調控花青苷合成的兩個基因MrMYB1和MrbHLH1重組，構建成表達質粒，采用煙草葉片瞬時表達技術篩選可調控花青苷合成的基因，將確認功能的基因轉化到煙草，培育出富含花青苷的煙草。本發明專利技術提供了一種培育富含花青苷煙草的方法，使得減輕吸煙帶來的健康危害成為可能。本方法同樣適用于楊梅以外的MYB和bHLH基因。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于植物分子生物技術和基因工程領域，涉及一種培育富含花青苷煙草的方法及其應用。
技術介紹
吸煙嚴重影響人體健康。吸煙不僅可誘導心血管病、慢性肺病和癌癥，而且會增加傳染病的發生概率，直接導致嚴重流行性感冒、侵入性肺炎和結核病的發病幾率上升；引起眾多的生殖并發病，包括不育、自發性流產、嬰兒體重過輕和夭折等綜合癥狀；使人體產生胰島素抗性，是糖尿病發病的重要因素，而且會加速吸煙者患血管病的進程；還會影響手術后身體的恢復，包括延緩傷口愈合和增加傷口感染的幾率等。隨著人們健康觀念的不斷提升，發達國家中煙民的數量有所減少，然而在較多發展中國家中，仍有超過40%人口的煙民。多數煙民都有嚴重的煙癮，從而無法通過戒煙來避免吸煙引起的疾病。對于這部分煙民來說，選擇含較少有害物質的煙草可能是一個可行的策略。花青苷屬于黃酮類化合物，廣泛存在于絕大部分陸生植物的液泡中，是紅色、藍色和紫色色澤的主要構成物。花青苷具有多種重要功能。除作為天然色素外，花青苷還具有很強的抗氧化、清除氧自由基的能力，是具有保健功能的天然活性物質，被譽為繼水、蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質之后的第七大必需營養。長期以來，花青苷已成為植物營養素或食品健康的重要標志。由于其具有極高的抗氧化活性，花青苷對心血管疾病、神經元和衰老相關疾病和癌癥等均具一定預防功效。本實驗室研究發現，楊梅果實中花青苷等酹類物質的含量與抗氧化活性呈顯著正相關關系，其中矢車菊素-3-0-葡萄糖苷是楊梅果實中主要的抗氧化物質；通過口服糖耐量試驗(OGTT)發現，楊梅果實花青苷粗提物可顯著降低大鼠血糖，改善糖尿病鼠的糖耐量能力；楊梅果實花青苷可抑制腫瘤細胞MMP-2蛋白的表達，從而抑制胃癌腫瘤細胞的活性`。此外，花青苷還可有效抑制肥胖和降低血脂，改善血糖平衡，促進視紫紅質再生進而增強視力敏銳性，預防大腦中樞栓塞和缺血癥狀。因而花青苷成為天然色素中最具有發展前景的一類色素。花青苷的代謝途徑已較為透徹，目前研究已達到轉錄調控的水平。即在花青苷的合成代謝過程中，相關的合成基因呈現較嚴格的時間和空間上的協同表達現象，經研究發現，這種現象是由轉錄調控基因統一調節的。花青苷合成相關的轉錄調控基因主要涉及三大轉錄因子家族，分別是R2R3-MYB轉錄因子、basic helix-loop-helix (bHLH)轉錄因子和WD40蛋白。由這三大轉錄因子構成的MYB-bHLH-WD40 (MBff)轉錄復合體，對花青苷生物合成的后期合成基因的表達的轉錄調控尤為顯著。其中，MBff轉錄復合體中MYB和bHLH轉錄因子對花青苷的合成調控較為特異。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種培育富含花青苷煙草的方法，使得減輕吸煙帶來的健康危害成為可能。以楊梅果實中已確認可調控花青苷合成的#r#7S7和為例，對該專利技術方法進行具體闡述。本專利技術方法同樣適用于楊梅以外其他可調控花青苷合成的MYB和bHLH基因。本專利技術的具體實施步驟如下1、表達載體構建根據已確認的#r#7價(SEQ N0.1)的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點的引物對SEQ :Ν0· 2和SEQ:N0. 3，根據已確認的份(SEQ :Ν0· 4)的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點的引物對SEQ :Ν0. 5和SEQ:N0. 6。以楊梅成熟果實cDNA為模板，PCR擴增兩個基因的開放性閱讀框，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，回收后經相應限制性內切酶處理，酶切產物再次用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收，然后連接到同樣經相應限制性內切酶處理的pGreenll SK表達載體上，分別進行#r#7價取MrbHLHl過量表達載體的構建。2、雙價表達載體的構建首先以表達質粒pGreenll SK為模板，設計引物對SEQ :NO. 8和SEQ:N0. 9擴增CaMV加尾信號序列，引物對SEQ :N0. 10和SEQ :N0. 11擴增35S啟動子序列。以‘荸薺’種楊梅的cDNA為模板，引物對SEQ N0. 12和SEQ N0. 13擴增MrMYBl的開放性閱讀框片段，引物對SEQ :NO. 14和SEQ :NO. 15擴增MrbHLHl的開放性閱讀框片段。第二輪PCR時，不加引物，擴增出融合這些片段的中間產物；最后一輪PCR，以中間產物為模板，SEQ :N0. 8和SEQ:N0. 15為引物對，擴增出融合的MrMYBl - CaMV term -CaMV 35S - MrbHLHl片段。將所得融合片段插入到的表達質粒pGreenll SK的多克隆位點內，完成雙價表達載體的構建。 將重組的表達質粒用電穿孔的方法轉化到GV3101: :pSoup農桿菌感受態細胞中，篩選陽性克隆保存成甘油農桿菌形式，用于進一步的煙草瞬時表達和轉基因實驗。3、基因的功能預測將存放于-80°c的各個甘油農桿菌劃線接種于含25 μ g/ml慶大霉素、5 μ g/ml四環素和50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養基上，28°C培養48 h，挑取少量菌落涂布到另一個含相同抗生素的LB固體培養基上，28°C培養24 h。用10 mM MgCl2,10 mM生物緩沖液(MES)，150 mM乙酰丁香酮，pH為5. 6的滲透液懸浮，使其0D_為O. 2。含不同基因的菌株滲透液分別于含P19質粒的菌株滲透液等比例混勻，然后用無針頭注射器將滲透液注入6周大的、有6-8片真葉的普通煙草葉片中，注射部位為遠離葉片中心葉脈的表皮細胞內。煙草于16h :8h光暗周期、25°C、75%空氣濕度的條件下培養8天后，觀察葉片的注射部位有無花青苷的積累，依此鑒定注射的基因有無調控花青苷合成的功能。4、煙草轉基因技術將含有煙草葉片瞬時表達技術篩選的可調控花青苷合成的基因的甘油農桿菌劃線接種于含25 μ g/ml慶大霉素、5 μ g/ml四環素和50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養基上,28°C培養48 h,挑取少量菌落涂布到另一個含相同抗生素的LB固體培養基上，28°C培養24 h。刮取少許菌落置于含25 μ g/ml慶大霉素、5 μ g/ml四環素和50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養基中，28°C 100 rpm過夜培養。室溫、5000 rpm離心收集菌落，用煙草轉基因浸染液懸浮后備用。取無菌煙草組織培養苗的幼嫩真葉葉片，置于浸染液中，并切成2-3 _長寬的葉片。將葉片上的農桿菌菌液用無菌濾紙吸干后，置于共培養基上培養2天，然后將葉片依次置于不定芽誘導培養基和根誘導培養基上培養，約2月后可得到完整轉基因煙草植株。5、轉基因煙草植株的檢測用終點法PCR技術分析外源基因表達模式，確認轉基因是否成功。參考CTAB方法提取轉基因煙草植株的總RNA，逆轉錄合成cDNA后，采用外源基因特異引物進行外源基因的擴增。PCR體系為25 μ 1，包含2. 5 μ I IOXPCR Buffer,O. 5 μ I 10 mM dNTP,上下游引物各 I μ I, I μ I 50 mM MgCl2,0. 2 μ I Invitrogen PlatinumTaq (Invitrogen)，I μ I cDNA 和 17. 8 μ I PCR 級水。PCR 程序為95 oC 5 min, 28 個循環(95 oC 30s, 58 oC本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種培育富含花青苷煙草的方法，其特征在于，通過以下步驟實現：（1）表達載體構建：根據序列為SEQ：NO.?1的MrMYB1的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點的序列為SEQ：NO.?2和SEQ：NO.?3的引物對，根據序列為SEQ：NO.?4的MrbHLH1的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點序列為SEQ：NO.?5和SEQ：NO.?6，PCR的引物對，擴增兩個基因的開放性閱讀框，然后采用相應的內切酶處理擴增產物和表達質粒pGreenII?SK，最后通過連接相對應的PCR產物和質粒，分別進行MrMYB1和MrbHLH1過量表達載體的構建；（2）雙價表達載體構建：根據表達質粒pGreenII?SK序列為SEQ：NO.?7，設計序列為SEQ：NO.?8和SEQ：NO.?9的引物對，擴增CaMV?加尾信號序列，引物對SEQ：NO.?10和SEQ：NO.?11擴增35S啟動子序列，根據融合PCR技術原理設計引物對SEQ：NO.?12和SEQ：NO.?13擴增MrMYB1的開放性閱讀框片段，引物對SEQ：NO.?14和SEQ：NO.?15擴增MrbHLH1的開放性閱讀框片段，應用融合PCR技術進行含MrMYB1?MrbHLH1雙價載體的構建，第一輪PCR分別擴增出CaMV加尾信號、35S啟動子、MrMYB1和MrbHLH1序列，第二輪PCR擴增出中間產物模板，第三輪PCR擴增出最終融合目的片段；（3）基因的功能預測：應用農桿菌介導的煙草葉片瞬時表達技術，將含有各表達載體的農桿菌滲透液，輸入煙草葉片表皮細胞內，植株置于溫室培養8天后觀察葉片中花青苷合成情況，若輸入孔周圍有花青苷積累，說明輸入葉片的基因具有誘導花青苷積累的功能；（4）煙草轉基因技術：將采用瞬時表達技術篩選的含有效基因表達載體的農桿菌菌株浸染帶有傷口的無菌煙草組培苗葉片，然后置于含抗生素的不定芽誘導培養基培養4周，再轉到含抗生素的根誘導培養基上培養4周，得到完整的轉基因植株，最后經過煉苗，將植株置于室外培養至開花結果。...

【技術特征摘要】
1.一種培育富含花青苷煙草的方法，其特征在于，通過以下步驟實現 (1)表達載體構建根據序列為SEQN0.1飽MrMYBl的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點的序列為SEQ N0. 2和SEQ N0. 3的引物對，根據序列為SEQ N0. 4飽MrbHLHl的序列全長設計含限制性內切酶酶切位點序列為SEQ N0. 5和SEQ N0. 6,PCR的引物對，擴增兩個基因的開放性閱讀框，然后采用相應的內切酶處理擴增產物和表達質粒PGreenIISK，最后通過連接相對應的PCR產物和質粒，分別進行#r#7S7取MrbHLHl過量表達載體的構建； (2)雙價表達載體構建根據表達質粒pGreenllSK序列為SEQ N0. 7，設計序列為SEQ N0. 8和SEQ N0. 9的引物對，擴增CaMV加尾信號序列，引物對SEQ N0. 10和SEQ NO. 11擴增35S啟動子序列，根據融合PCR技術原理設計引物對SEQ NO. 12和SEQ NO.13擴增MrMm的開放性閱讀框片段，引物對SEQ NO. 14和SEQ NO. 15貧箄MrbHLHl的開放性閱讀框片段，應用融合PCR技術進行含份雙價載體的構建，第一輪PCR分別擴增出CaMV加尾信號、35S啟動子、MrMYBl和MrbHLHl序列，第二輪PCR擴增出中間產物模板，第三輪PCR擴增出最終融合目的片段； (3)基因的功能預測應用農桿菌介導的煙草葉片瞬時表達技術，將含有各表達載體的農桿菌滲透液，輸入煙草葉片表皮細胞內，植株置于溫室培養8天后觀察葉片中花青苷合成情況，若輸入孔周圍有花青苷積累，說明輸入葉片的基因具有誘導花青苷積累的功能； (4)煙草轉基因技術將采用瞬時表達技術篩選的含...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫崇德，徐昌杰，殷學仁，劉曉芬，李鮮，張波，陳昆松，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：