抗紋枯病轉基因水稻的培育及專用載體制造技術

本發明專利技術公開了一種GAFP2蛋白在培育抗紋枯病轉基因水稻中的應用及專用載體。本發明專利技術提供了GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗病性中的應用；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N‘末端第29-171位氨基酸殘基。本發明專利技術的實驗證明：將GAFP2導入水稻中獲得轉基因水稻，可以有效增強對水稻紋枯病的抗性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，尤其涉及一種抗紋枯病轉基因水稻的培育及專用載體。
技術介紹
水稻紋枯病（sheath?blight）是由立枯絲核菌(Rhizoctonia?solani?Kühn)引起的土傳真菌病害。上世紀60年代以來，伴隨著矮稈品種的推廣、密植和化肥的大量施用，紋枯病在世界范圍內成為水稻三大病害之一，一般造成15％－20％的減產，嚴重時可減產60％－70％。該病屬于葉鞘病害，始于植株基部。在水稻群體條件下，一般于分蘗后期至拔節初期和抽穗期前后20天左右形成2個發病高峰，特別是后一個發病高峰，菌絲體不僅快速向植株冠層擴展（縱向擴展），而且迅速橫向蔓延，使周圍健康植株生病，危害十分嚴重。病原菌（R.solani?kühn）不僅危害葉鞘，而且可致葉片發病或失水枯死，影響群體光合作用，嚴重時會致莖稈腐爛而成片倒伏、穎殼發病、穗子枯死甚至不能完全抽出，對產量和品質影響巨大。由于水稻推廣品種的抗性水平普遍不理想，迄今為止，生產上對該病的控制主要依賴化學防治。但在當前高肥、大群體和農村輕壯年勞動力大量轉移的情況下，常常由于用藥不及時或方法不正確，導致防治效果普遍不佳，紋枯病作為主要病害的地位越來越突出，乃至我國南方稻區的很多地方，該病已上升為水稻第一大病害。培育抗紋枯病水稻新品種是從根本上解決紋枯病危害的唯一出路，也已成為我國水稻生產上的當務之急。隨著分子生物學、植物病理學和基因工程技術的迅猛發展，運用基因工程手段提高植物的抗病性，為抗病育種開辟了一條全新的途徑。
技術實現思路
本專利技術一個目的是提供GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體的應用。本專利技術提供的GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗病性中的應用；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N‘末端第29-171位氨基酸殘基。上述序列表中的序列2由171個氨基酸構成，自氨基末端第1-28位為信號肽，自氨基末端第29-171位為GAFP2蛋白。上述應用中，所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1或序列表中序列1自5’末端第85-516位核苷酸。上述序列表中的序列1由516個核苷酸構成，自5‘末端第1-84位為編碼信號肽的基因，自5‘末端第85-516位為編碼GAFP2蛋白的基因。上述應用中，所述調控植物抗病性為提高植物紋枯病抗性；所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻。水稻的品種名具體為水稻“徐稻3號”。上述應用中，所述提高植物紋枯病抗性為提高水稻紋枯病抗性；所述水稻紋枯病具體由立枯絲核菌（Rhizoctonia?solani?Kühn）引起。本專利技術的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。本專利技術提供的方法，為將GAFP2蛋白的編碼基因導入目的植物得到轉基因植物，所述轉基因植物的紋枯病抗性高于所述目的植物；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N‘末端第29-171位氨基酸殘基。上述方法中，所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1或序列表中序列1自5’末端第85-516位核苷酸。上述方法中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻；水稻的品種名具體為水稻“徐稻3號”。所述紋枯病為水稻紋枯病，所述水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia?solani?Kühn）引起；所述GAFP2蛋白的編碼基因通過下述第三個目的中的重組載體導入所述目的植物中。本專利技術的第三個目的是提供一種重組載體。本專利技術提供的重組載體，為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅動所述編碼基因的啟動子插入表達載體得到；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N‘末端第29-171位氨基酸殘基。上述啟動子可為組成型、維管組織特異表達或真菌誘導型啟動子，所述組成型啟動子優選為35S啟動子。上述重組載體為將GAFP2蛋白的編碼基因和驅動所述編碼基因的啟動子35S插入表達載體pCambia2300中得到的載體；所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1或序列表中序列1自5’末端第85-516位核苷酸。上述重組載體具體按照如下方法制備：1）將所述GAFP2蛋白的編碼基因替換pBI221載體中的GUS片段，得到的中間載體pBI?35S-GAFP2；將所述GAFP2蛋白的編碼基因替換pBI221載體中的GUS片段進一步具體為將上述序列表中序列1所示的核苷酸取代pBI221載體的XbaI和SacI酶切識別位點間的小片段（GUS片段）得到的重組載體。2）用HindIII和SacI酶切中間載體pBI35S-GAFP2得到1300bp35S-GAFP2片段，將所述35S-GAFP2片段插入pCambia2300載體HindIII和SacI酶切位點間得到重組載體。含有上述表達載體的重組菌或轉基因細胞系也是本專利技術保護的范圍。本專利技術的實驗證明：將含有信號肽的GAFP2基因導入水稻中獲得轉基因水稻，可以高效地抵抗紋枯病菌的侵染，與非轉基因水稻相比，轉GAFP2水稻具有穩定的、明顯增強的抗紋枯病能力，其病指數顯著降低，說明轉GAFP2水稻表達的GAFP2蛋白能夠在信號肽的引導下將成熟肽GAFP2準確定位于胞外，從而有效增強了轉基因植物對真菌病源物侵染的抗性。附圖說明圖1為轉GAFP2水稻株系的分子鑒定結果圖2為水稻紋枯病菌的培養及水稻接種圖片具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、含有GAFP2的高效表達載體pCambia2300-35S-GAFP2的構建人工合成GAFP2基因，GAFP2的核苷酸序列為序列表中的序列1，該基因編碼的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述序列表中的序列1由516個核苷酸構成，自5‘末端第1-84位為編碼信號肽的基因，自5‘末端第85-516位為編碼GAFP2蛋白的基因。上述序列表中的序列2由171個氨基酸構成，自氨基末端第1-28位為信號肽，自氨基末端第29-171位為GAFP2蛋白。將GAFP2基因（序列表中的序列1）連接到pUCm-T（購自上海生工生物工程有限公司）上，構建載體pUCm-GAFP2。用XbaI和SacI酶切pUCm-GAFP2，得到516bp酶切后的GAFP2片段，經該片本文檔來自技高網...

【技術保護點】
GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗病性中的應用；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N‘末端第29？171位氨基酸殘基。

【技術特征摘要】
1.GAFP2蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗病性中
的應用；所述GAFP2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N‘末端
第29-171位氨基酸殘基。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:
所述GAFP2蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列1或序列表中序列1
自5’末端第85-516位核苷酸。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于:
所述調控植物抗病性為提高植物紋枯病抗性；
所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為水稻。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:
所述提高植物紋枯病抗性為提高水稻紋枯病抗性；
所述水稻紋枯病具體由立枯絲核菌（Rhizoctonia?solani?Kühn）引起。
5.一種培育轉基因植物的方法，為將GAFP2蛋白的編碼基因導入目的植物得到轉
基因植物，所述轉基因植物的紋枯病抗性高于所述目的植物；所述GAFP2蛋白的氨基
酸序列為序列表中序列2或序列表中序列2自N‘末端第29-171位氨基酸殘基。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：所述GAFP...

【專利技術屬性】
技術研發人員：儲成才，王義琴，劉豐澤，陳帥，
申請(專利權)人：中國科學院遺傳與發育生物學研究所，
類型：發明
國別省市：