制備具有改進特性的抗體的方法技術

本發明專利技術涉及產生包含Fc的多肽的方法和其組合物，所述包含Fc的多肽具有改進的特性并且在Fc區的243和264位包含突變。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于產生糖基化蛋白(糖蛋白)以及具體而言包含Fe的多肽的方法及其組合物，所述包含Fe的多肽用作人或動物的治療藥物。
技術介紹
單克隆抗體經常通過兩個結合事件獲得它們的治療效果。首先，抗體的可變結構域結合靶細胞上的特定蛋白，例如，癌癥細胞的表面上的CD20。這隨后招募效應細胞如自然殺傷(NK)細胞，該自然殺傷(NK)細胞結合抗體的恒定區(Fe)并破壞該抗體結合的細胞。這個過程，被稱為抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC)，其取決于IgGl重鏈的Fe結構域中Asn297 的特定 N-糖基化事件，Rothman 等，Mol.Tmmunol.26:1113-1123 (1989)。缺乏這種N-糖基化結構的抗體仍然結合抗原，但不能介導ADCC，顯然是由于抗體的Fe結構域對NK細胞表面上Fe受體Fe Y RIIIa的親和力降低的結果。不僅N-糖基化的存在在抗體的效應功能中起作用，N-連接的寡糖的特定組成對其最終功能同樣重要。巖藻糖的缺乏或二分的(bisecting)N-乙酰基葡萄糖胺的存在與 ADCC 的效力正相關，Rothman (1989), Umana 等，Nat.Biotech.17:176-180(1999)，Shields 等 ，T.Biol.Chem.277:26733-26740 (2002),和 Shinkawa 等，LBiol.Chem.278:3466-3473 (2003).。也有證據表明，Fe區的唾液酸化與靜脈內免疫球蛋白(IVIG)的抗炎特性正相關。見，例如，Kaneko等，Science.313:670-673，2006;Nimmerjahn 和 Ravetch.，T.Exp.Med., 204:11-15，2007。鑒于特定N-糖基化在抗體的功能和效力中的實用性，用于修飾N-連接的寡糖的組成和修飾抗體的效應功能的方法是期望的。酵母和其它真菌宿主是用于產生重組蛋白的重要的生產平臺。酵母是真核生物，因此，和更高等真核生物具有共同的進化過程，包括許多在分泌途徑中發生的翻譯后修飾。糖工程化中的最新進展產生了具有轉基因修飾的糖基化途徑的酵母株巴斯德畢赤酵母(Pichia pastor is)的細胞系,該糖基化途徑允許它們進行一系列的酶反應,所述酶反應模擬人中糖基化的過程。見，例如，美國專利號7，029，872，7，326，681和7，449，308，其中記載了用于在低等真核宿主細胞中產生與它們的人對應物基本相同的重組糖蛋白的方法。人樣唾液酸化雙向觸角復合物N-連接的聚糖，如前述方法在巴斯德畢赤酵母iPichiapastoris)中產生的那些聚糖，已經顯示了產生治療性糖蛋白的實用性。因此，用于進一步修飾或改進酵母如巴斯德畢赤酵母中的抗體的生產方法是期望的。專利技術概述 本專利技術涉及包含Fe的多肽，所述包含Fe的多肽包含Fe區的243和264位氨基酸的突變，其中 243位的突變選自:F243A, F243G, F243S, F243T, F243V, F243L, F243I, F243D,F243Y, F243E, F243R, F243W和 F243K，264位的突變選自:V264A, V264G, V264S, V264T,V264D, V264E, V264K, V264W, V264H, V264P, V264N, V264Q和V264L，其中根據如Kabat中的EU索引編號。在另一個實施方案中，包含Fe的多肽包含突變F243A和V264A。在另一個實施方案中，包含Fe的多肽包含突變F243Y和V264G。在另一個實施方案中，包含Fe的多肽包含突變F243T和V264G。在另一個實施方案中，包含Fe的多肽包含突變F243L和V264A。在另一個實施方案中，包含Fe的多肽包含突變F243L和V264N。在另一個實施方案中，包含Fe的多肽包含突變F243V和V264G。在一個實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽是抗體或抗體片段。在一個實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽是包含SEQ ID NO: 18的抗體片段。在另一個實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽是包含SEQ ID NO: 19的抗體片段。在另一個實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽是由(或基本上由)SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 19組成的抗體片段。在一個實施方案中，包含Fe的多肽是包含SEQ ID NO:9的重鏈氨基酸序列或其變體以及SEQ ID NO: 2的輕鏈氨基酸序列或其變體的抗體。在一個實施方案中，包含Fe的多肽是包含SEQ ID NO:9的重鏈氨基酸序列減去SEQ ID N0:9中列出的最后的賴氨酸(K)殘基的抗體。 在一個實施方案中，包含Fe的多肽是包含SEQ ID NO: 12的重鏈氨基酸序列或其變體以及SEQ ID NO: 11的輕鏈氨基酸序列或其變體的抗體。在一個實施方案中，包含Fe的多肽是包含SEQ ID NO: 15的重鏈氨基酸序列或其變體以及SEQ ID NO: 14的輕鏈氨基酸序列或其變體的抗體。在一些實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽含有包含唾液酸(包括NANA，NGNA及其類似物和衍生物)的N-聚糖。在一個實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽是α_2，3和α-2，6連接的唾液酸的混合物。在另一個實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽僅包含α-2，6連接的唾液酸。在一個實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽包含α-2，6連接的唾液酸，不包含可檢測水平的α _2，3連接的唾液酸。在一個實施方案中，唾液酸是N-乙酰神經氨酸(NANA)或N-羥乙酰神經氨酸(NGNA)或其混合物。在另一個實施方案中，唾液酸是在唾液酸的9位具有乙酰化的NANA或NGNA的類似物或衍生物。在一個實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽的N-聚糖包含NANA并且不包含NGNA。本專利技術的包含Fe的多肽上的N-聚糖可以任選地包含巖藻糖。在一個實施方案中，本專利技術的包含Fe的多肽上的N-聚糖將包含巖藻糖基化的和非巖藻糖基化的N-聚糖的混合物。在另一個實施方案中，包含Fe的多肽上的N-聚糖缺乏巖藻糖。在一個實施方案中，當與母體的包含Fe的多肽相比時，本專利技術的包含Fe的多肽具有下列特性中的一種或多種:(i)降低的效應功能；(ii)增加的抗炎特性；(iii)增加的唾液酸化；(iv)增加的生物利用度(吸收或暴露)，以及(V)與Fe Y RI，FcyRIIa, FcyRIIb,Fe Y RIIIa (Fe Y RIIIa_V158 或 Fe Y RIIIa_F158)，和 Fe Y RIIIb 結合的降低。在一個實施方案中，與母體的包含Fe的多肽相比，本專利技術的包含Fe的多肽具有效應功能的至少7，10，15，30, 50, 100, 500或1000倍降低。在一個實施方案中，效應功能是ADCC。在另一個實施方案中，效應功能是CDC。在一個實施方案中，當與母體的包含Fe的多肽相比時，本專利技術的包含Fe的多肽具有降低的ADCC活性。在一個實施方案中，包含Fe的多肽具有ADCC活性的至少7，10，15，30，50 100，500或1000倍降低。在另一個實施方案中，包含Fe的多肽具有ADCC活性的至少100倍降低。在另一個實施方案中，包本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.05.27 US 61/348,9681.包含Fe的多肽，其包含Fe區的243和264位氨基酸的突變，其中所述243位的突變選自:F243A、F243G、F243S、F243T、F243V、F243L、F2431、F243D、F243Y、F243E、F243R、F243W 和 F243K，所述 264 位的突變選自:V264A、V264G、V264S、V264T、V264D、V264E、V264K、V264W、V264H、V264P、V264N、V264Q 和 V264L，其中根據如 Kabat 中的 EU 索引編號。2.權利要求1的包含Fe的多肽，其中所述243和264位的突變選自:a)F243A 和 V264A ；b)F243Y 和 V264G ；c)F243T 和 V264G ；d)F243L 和 V264A ；e)F243L 和 V264N ;和f)F243V 和 V264G。3.權利要求1的包含Fe的多肽，其中所述包含Fe的多肽是抗體或抗體片段。4.權利要求1的包含Fe的多肽，其中所述包含Fe的多肽包含唾液酸化的聚糖。5.權利要求4的包含Fe的多肽，其中所述唾液酸化的N-聚糖中的唾液酸殘基通過α-2，6連接而連接。6.權利要求1的包含Fe的多肽，其中，當與母體的包含Fe的多肽相比時，所述包含Fe的多肽具有下列特性中的一種或多種: a)降低的效應功能， b)增加的抗炎特性， c)增加的唾液酸化， d)當腸胃外施用時增加的生物利用度，以及e)與Fe Y RI, Fe Y RIIa, Fe Y RIIb 和 Fe y RIIIa 結合的降低。7.在宿主細胞中產生包含Fe的多肽的方法，包括: a)提供已經被基因工程化以生產包含Fe的多肽的基因修飾的細胞，其中所述宿主細胞包含編碼Fe區的243和264位氨基酸的突變的核酸，其中所述243位的突變選自:F243A、F243G、F243S、F243T、F243V、F243L、F2431、F243D、F243Y、F243E、F243R、F243W 和 F243K,所述 264 位的突變選自:V264A、V264G、V264S、V264T、V264d、V264E、V264K、V264W、V264H、V264P、V264N、V264Q和V264L，其中根據如Kabat中的EU索引編號； b)在引起所述包含Fe的多肽的表達的條件下培養所述宿主細胞；以及 c)從所述宿主細胞分離所述包含Fe的多肽。8.權利要求7的方法，其中所述核酸編碼選自如下的突變:a) F243A 和 V264A ；b)F243Y 和 V264G ；c)F243T 和 V264G ；d)F243L 和 V264A ；e)F243L 和 V264N ;和f)F243V 和 V264G。9.權利要求7的方法，其中所述包含Fe的多肽是抗體或抗體片段。10.權利要求7的方法，其中所述包含Fe的多肽包含唾液酸化的N-聚糖。11.權利要求10的方法，其中所述唾液酸化的N-聚糖中的唾液酸殘基通過α-2，6連接而連接。12.權利要求10的方法，其中所述包含Fe的多肽具有聚糖組合物，其中相對于母體的包含Fe的多肽，總的唾液酸化的聚糖的量和百分比增加。13.權利要求7的方法，其中，當與母體的包含F...

【專利技術屬性】
技術研發人員：TA斯塔德黑姆，D查，L劉，
申請(專利權)人：默沙東公司，
類型：
國別省市：