一種利用兩親性殼聚糖微球載體制備固定化脂肪酶的方法，涉及一種制備固定化脂肪酶的方法，以反相懸浮交聯法制備微米級殼聚糖微球樹脂作為固定化載體基體，將殼聚糖微球基質C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基團，再用環氧氯丙烷活化C6位羥基，偶聯四乙烯五胺，制備兼具疏水作用苯基和親水性多胺分子的殼聚糖微球，經偶聯戊二醛后作為脂肪酶的共價固定化載體。采用該載體對南極假絲酵母脂肪酶B進行固定化，疏水性基團和親水性手臂分子的引入提高了殼聚糖微球對脂肪酶的固定化效率。當每克干載體投加的酶質量為40mg，室溫，pH7.5的條件下固定南極假絲酵母脂肪酶3h，所得到的固定化酶活力回收率達197％，活力為481.6U/g。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種制備固定化脂肪酶的方法，特別是涉及。
技術介紹
脂肪酶(EC.3.1.1.3)是一類特殊的酰基水解酶，為應用最廣泛的酶催化劑之一，除了能夠催化甘油酯類化合物的水解之外，還可以用于在非水相中催化酯交換、高聚物合成、多肽合成、立體異構拆分和手性藥物的合成等。南極假絲酵母脂肪酶(CandidaAntarctic lipase B，CALB)是一種重要的脂肪酶，在水解和有機合成反應中具有高度的立體選擇性，對非水溶性和水溶性物質都有很強的催化活性。近年的研究成果表明，CALB在多種類型的反應中都顯示了較其它脂肪酶更為出色的催化性能。脂肪酶價格昂貴，雖然游離酶催化反應技術成熟，但酶不能重復使用，難以實現過程的連續化，工業化成本高而難以推廣。固定化脂肪酶，是非水相催化中的常用形式，可以克服游離酶催化的缺點。應用于非水相中的固定化脂肪酶目前多采用吸附法制備，如諾維信公司生產的Novozyme 435 (吸附固定于大孔丙烯酸樹脂的CALB),但即使在非水相中仍然存在酶從載體上脫落的問題。共價結合法具有酶與載體結合牢固，可長時間連續重復使用的優點，符合工業化應用的要求。構建性能優良的載體往往是酶固定化成功與否的關鍵。研究表明，載體表面接枝手臂分子有利于提高固定化酶活性[Barbara Krajewska.Application of chitin—and chitosan—based materials for enzyme immobilizations:a review.Enzyme and Microbial Technology，2004，25:126-139]，具適當疏水表面的載體比具親水表面的載體更適于用作脂肪酶固定化載體[Petkar M, Lali A, Caimi P,Daminati M.1mmobilization of lipases for non—aqueous synthesis.J Mol CatalB Enzym, 2006，39:83-90]。但 Blanco 等[Blanco R M, Terreros P, Munoz N, et al.Ethanol improves lipase immobilization on a hydrophobic support.Journal ofMolecular Catalysis B: Enzymatic, 2007, 47: 13-20]指出疏水性太強的載體也并不一定是最好的，疏水性太強的表面在與水分子接觸時，其接觸角往往大于90°，導致水相不能進入到內部，因而載體只能在其外部吸附一些酶蛋白，減少了載體的載酶量。殼聚糖是一種性質優良的固定化載體，生物相容性好、無毒、具有許多可供改性且親水的氨基和羥基。然而，目前采用殼聚糖特別是改性殼聚糖微球載體共價固定化脂肪酶的報道還很少，這些研究或未將殼聚糖制備成可大量生產的微米級微球，或是制備的殼聚糖微球未連接手臂分子，也沒考慮到給微球表面提供適當的疏水區，這必然影響到制備高活力的固定化脂肪酶，所以開發性能優良的殼聚糖基脂肪酶固定化載體仍很有必要。基于此，我們以反相懸浮交聯法制備微米級殼聚糖微球樹脂作為固定化載體基體，將殼聚糖微球基質C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基團，再用環氧氯丙烷活化C6位羥基，偶聯四乙烯五胺，制備兼具疏水作用苯基和親水性多胺手臂分子的殼聚糖微球，經偶聯戊二醛后作為酶的共價固定化載體。采用該載體對南極假絲酵母脂肪酶進行固定化，提高固定化酶活力。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供，以反相懸浮交聯法制備微米級殼聚糖微球樹脂作為固定化載體基體，疏水性基團和親水性手臂分子的引入，極大提高了殼聚糖微球對脂肪酶的固定化效率。本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的: ，所述方法包括: a.制備兩親性殼聚糖微球載體:該載體基質為微米級殼聚糖微球，將殼聚糖微球基質C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基團，再用環氧氯丙烷活化C6位羥基，偶聯四乙烯五胺，制備兼具疏水作用苯基和親水性多胺手臂分子的殼聚糖微球，具體制備過程如下: ⑴殼聚糖微球基質的制備:將質量分數為5%的殼聚糖溶液與PEG2000充分混合，PEG2000在溶液中的質量百分含量分別為3%，再加入與殼聚糖溶液等體積的液體石蠟及乳化劑span-80，高速攪拌30min使體系成乳液狀，然后加入0.12倍殼聚糖溶液體積的甲醛，攪拌Ih后將乳液倒入10 % Na OH/無水乙醇(V(NaOH): V (無水乙醇)=1:1)的混合液中靜置lh，用二甲苯、乙醇、去離子水充分洗滌，得到粒徑lOOlOOym的殼聚糖微球作為基質；⑵基質微球的基團修飾:稱取殼聚糖微球于甲醇中，滴加苯甲醛，苯甲醛與微球質量比3飛，60°C恒溫振蕩反應l(Tl6h，再加入硼氰化鈉室溫反應12h，抽濾洗滌后將微球浸泡在氫氧化鈉水溶液中、緩慢加入環氧氯丙烷，環氧氯丙烷與微球質量比6 12，50°C振蕩反應5h，抽濾洗滌后將環氧化微球置于乙醇中，加入氫氧化鈉水溶液和四乙烯五胺，四乙烯五胺與微球質量比1(T15，55°C反應6h，抽濾，用蒸餾水充分洗滌，干燥，得兩親性殼聚糖微球載體； ⑶戊二醛活化:取兩親性殼聚糖微球置于燒瓶中，按5倍氨基摩爾數的量加入戊二醛溶液，以乙醇作為反應介質60°C反應1.5h，抽濾，然后用蒸餾水、pH7.5的磷酸緩沖液洗滌，真空干燥，得戊二醛活化載體。b.制備固定化脂肪酶:將戊二醛活化載體分散于磷酸緩沖液中，室溫下，力口入脂肪酶，脂肪酶與載體的質量比為0.02、.15:1，固定化溫度為20 401:，固定化時間為2飛h，固定化pH7.5^8.0，在搖床中振蕩2飛h，吸去酶液，用磷酸緩沖液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4°C冰箱中保存即可。所述的，所述的疏水作用基團為苯基，親水性手臂分子為多胺。所述的，所述兩親性殼聚糖微球載體的粒徑為IOOlOOiI m。所述的，所述苯基密度為1.5-2.2mmol / g載體，氨基密度為2.8_3.6mmol / g載體。本專利技術的優點與效果是: 本專利技術制備了一種改性殼聚糖微球作為脂肪酶的共價固定化載體。該載體兼具疏水性基團和親水性手臂分子，即疏水性苯基和親水性多胺手臂分子。利用該載體對脂肪酶固定化后大大提高了殼聚糖微球對脂肪酶的固定化效率，所得到的固定化酶活力回收率高達197%，活力為481.6U/g，是采用未改性聚糖微球的固定化水平的14.8倍。具體實施例方式下面結合實施例對本專利技術進行詳細說明。以下通過實施例對本專利技術作進一步描述，但本專利技術的保護范圍不限于此。實施例中所用脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶，采用PNPP法測定脂肪酶的活性，以37°C、pH7.5時，每分鐘產生I U mo I的對硝基苯酚(pNP)所需的酶量為一個酶活力單位(U)。實施例中所用南極假絲酵母脂肪酶活力600(T7000U/g。實施例1.兩親性殼聚糖微球載體的制備: 將120ml質量分數為5%的殼聚糖溶液與3.5gPEG2000充分混合，再加入120ml液體石臘，18滴span-80,高速攪拌30min使體系成乳液狀,然后加入14ml甲醒,攪拌Ih后將乳液倒入10 % NaOH/無水乙醇(V(NaOH): V(無水本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用兩親性殼聚糖微球載體制備固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括：a.制備兩親性殼聚糖微球載體：該載體基質為微米級殼聚糖微球，將殼聚糖微球基質C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基團，再用環氧氯丙烷活化C6位羥基，偶聯四乙烯五胺，制備兼具疏水作用苯基和親水性多胺手臂分子的殼聚糖微球，具體制備過程如下：⑴殼聚糖微球基質的制備：將質量分數為5%的殼聚糖溶液與PEG2000充分混合，PEG2000在溶液中的質量百分含量分別為3%，再加入與殼聚糖溶液等體積的液體石蠟及乳化劑span?80，高速攪拌30min使體系成乳液狀，然后加入0.12倍殼聚糖溶液體積的甲醛，攪拌1h后將乳液倒入10﹪NaOH/無水乙醇(V(NaOH):V(無水乙醇)=1:1)的混合液中靜置1h，用二甲苯、乙醇、去離子水充分洗滌，得到粒徑100~300μm的殼聚糖微球作為基質；⑵基質微球的基團修飾：稱取殼聚糖微球于甲醇中，滴加苯甲醛，苯甲醛與微球質量比3~6，60℃恒溫振蕩反應10~16h，再加入硼氰化鈉室溫反應12h，抽濾洗滌后將微球浸泡在氫氧化鈉水溶液中、緩慢加入環氧氯丙烷，環氧氯丙烷與微球質量比6~12，50℃振蕩反應5h，抽濾洗滌后將環氧化微球置于乙醇中，加入氫氧化鈉水溶液和四乙烯五胺，四乙烯五胺與微球質量比10~15，55℃反應6h，抽濾，用蒸餾水充分洗滌，干燥，得兩親性殼聚糖微球載體；⑶戊二醛活化：取兩親性殼聚糖微球置于燒瓶中，按5倍氨基摩爾數的量加入戊二醛溶液，以乙醇作為反應介質60℃反應1.5h，抽濾，然后用蒸餾水、pH7.5的磷酸緩沖液洗滌，真空干燥，得戊二醛活化載體；b.?制備固定化脂肪酶:?將戊二醛活化載體分散于磷酸緩沖液中,?室溫下，加入脂肪酶，脂肪酶與載體的質量比為0.02~0.15:1，固定化溫度為20~40℃，固定化時間為2~6h，固定化pH7.5~8.0,在搖床中振蕩2~6h，吸去酶液，用磷酸緩沖液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4℃冰箱中保存即可。...
【技術特征摘要】
1.一種利用兩親性殼聚糖微球載體制備固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括: a.制備兩親性殼聚糖微球載體:該載體基質為微米級殼聚糖微球，將殼聚糖微球基質C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基團，再用環氧氯丙烷活化C6位羥基，偶聯四乙烯五胺，制備兼具疏水作用苯基和親水性多胺手臂分子的殼聚糖微球，具體制備過程如下: ⑴殼聚糖微球基質的制備:將質量分數為5%的殼聚糖溶液與PEG2000充分混合，PEG2000在溶液中的質量百分含量分別為3%，再加入與殼聚糖溶液等體積的液體石蠟及乳化劑span-80，高速攪拌30min使體系成乳液狀，然后加入0.12倍殼聚糖溶液體積的甲醛，攪拌Ih后將乳液倒入10 % NaOH/無水乙醇(V(NaOH): V (無水乙醇)=1:1)的混合液中靜置lh，用二甲苯、乙醇、去離子水充分洗滌，得到粒徑lOOlOOym的殼聚糖微球作為基質； ⑵基質微球的基團修飾:稱取殼聚糖微球于甲醇中，滴加苯甲醛，苯甲醛與微球質量比3飛，60°C恒溫振蕩反應10~l6h，再加入硼氰化鈉室溫反應12h，抽濾洗滌后將微球浸泡在氫氧化鈉水溶液中、緩慢加入環氧氯丙烷，環氧氯丙烷與微球質量比6 12，50°C振蕩反應5h，抽濾洗滌后將環 氧化微球置于乙醇中，加入氫氧化鈉水溶液和...
【專利技術屬性】
技術研發人員：朱建星，王紅艷，
申請(專利權)人：沈陽化工大學，
類型：發明
國別省市：
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