一種肌酸激酶固定化的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提出了一種肌酸激酶固定化的方法。它以殼聚糖為原料，先制備出交聯(lián)殼聚糖溶液，再制備出交聯(lián)殼聚糖微球，然后制備出接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂，最后以接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂為載體固定化肌酸激酶。本發(fā)明專利技術(shù)的優(yōu)點可以使用常規(guī)的生產(chǎn)設(shè)備在溫和的條件下生產(chǎn)磷酸肌酸，工藝簡單，操作簡便且易于控制，生產(chǎn)成本低，提高了生產(chǎn)效率，生產(chǎn)過程有利于保護環(huán)境；且制備的固定化肌酸激酶對熱、酸、堿、有機溶劑等條件的穩(wěn)定性都有顯著增加。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及肌酸激酶固定化制備
，具體涉及一種以接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖微球固定化肌酸激酶的方法。
技術(shù)介紹
肌酸激酶是一個與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，能可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng)。用于心肌梗塞的早期診斷，各種肌肉疾病的測定，以及制備磷酸肌酸等方面。游離肌酸激酶以兔肌肉為原料制備，價格昂貴，在溶液中不穩(wěn)定，容易變性失活，反應(yīng)后難以分離回收，無法重復(fù)利用。這極大地限制了肌酸激酶的應(yīng)用，特別是用在以肌酸激酶為催化劑制備磷酸肌酸的反應(yīng)中。酶的固定化是通過物理或化學(xué)方法使游離酶束縛于水不溶介質(zhì)中的過程，其目的是使被束縛的酶能連續(xù)進行反應(yīng)，反應(yīng)后便于回收酶并重復(fù)使用。與只能使用一次的游離酶相比，固定化酶既保留了游離酶的催化特性，又具有穩(wěn)定性好、反應(yīng)過程控制、可組裝成酶反應(yīng)器，進行多酶組合連續(xù)反應(yīng)、可再生并反復(fù)使用、成本低等優(yōu)點，是生物催化劑發(fā)展的熱門領(lǐng)域。現(xiàn)有的酶的固定化的工藝，例如2011年11月30號公開號為CN102260665A的“一種馬來酰化殼聚糖微球固定化脲酶的制備方法”專利，公開的方法是以一定配比的乳化劑、油相溶劑和單體組成油相，以一定配比的脲酶、引發(fā)劑和馬來酰化殼聚糖溶解到水中組成水相，將水相加入油相，加入交聯(lián)劑反應(yīng)，再經(jīng)洗滌，洗脫而制備出產(chǎn)品。該方法以馬來酸酐交聯(lián)殼聚糖氨基，在制備出馬來酰化殼聚糖微球固定化載體的同時將脲酶固定于微球內(nèi)，該方法的缺點是馬來酸酐在與殼聚糖游離氨基反應(yīng)的同時，也與脲酶的游離氨基反應(yīng)，還發(fā)生脲酶游離氨基間的交聯(lián)反應(yīng)，一部分固定化脲酶直接交聯(lián)于丁二酰骨架上，由于丁二酰基親水性差，會顯著擾動固定化脲酶的構(gòu)象，明顯降低固定化脲酶與底物的親和力；一部分通過馬來酸酐自交聯(lián)產(chǎn)生的固定化脲酶，由于體積顯著增大，導(dǎo)致其''剛性明顯增力口，催化活性顯著降低；此外，部分殼聚糖游離氨基與馬來酸酐交聯(lián)，形成交聯(lián)殼聚糖載體，顯著減少了參與固定化脲酶的殼聚糖游離氨基，導(dǎo)致固定化荷載小；加之馬來酸酐碳鏈較短、與游離氨基的反應(yīng)條件較苛刻，因此，以馬來酸酐為交聯(lián)劑制備的脲酶蛋白偶聯(lián)率低、活力回收低、與底物的親和力低、催化活力低。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提出，它能夠有效地克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，可以使用常規(guī)的生產(chǎn)設(shè)備在溫和的條件下生產(chǎn)磷酸肌酸，工藝簡單，操作簡便且易于控制，生產(chǎn)成本低，提高了生產(chǎn)效率，生產(chǎn)過程有利于保護環(huán)境；且制備的固定化肌酸激酶對熱、酸、堿、有機溶劑等條件的穩(wěn)定性都有顯著增加。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的，它以殼聚糖為原料，先制備出交聯(lián)殼聚糖溶液，再制備出交聯(lián)殼聚糖微球，然后制備出接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂，最后以接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂為載體固定化肌酸激酶。I、制備交聯(lián)殼聚糖溶液的步驟為(I)以殼聚糖為原料，按殼聚糖的質(zhì)量體積濃度為I 5%的鹽酸溶液的體積比為I :25 50的比例，將殼聚糖溶解于鹽酸溶液中，形成殼聚糖溶液；所述殼聚糖的質(zhì)量按克來計量，鹽酸溶液的體積按毫升來計量；( 2 )再在攪拌條件下在(I)步驟中加入等體積的液體石蠟進行分散，制備出液體石蠟分散的殼聚糖溶液；(3)然后按殼聚糖的質(zhì)量體積濃度為2. 5% 5. 0%的雙縮水甘油醚溶液的體積比為I : 10 30的比例，在液體石蠟分散的殼聚糖溶液中加入雙縮水甘油醚溶液，進行交聯(lián)反應(yīng)20 30分鐘，就制備出交聯(lián)殼聚糖溶液；所述殼聚糖的質(zhì)量按克來計量，雙縮水甘油 醚溶液的體積按暈升來計量。2、制備交聯(lián)殼聚糖微球的步驟為(I)將第I步中制備出的交聯(lián)殼聚糖溶液，先按致孔劑碳酸鈣殼聚糖的質(zhì)量比為I :1 3的比例，在交聯(lián)殼聚糖溶液中加入致孔劑碳酸鈣粉末，攪拌混合均勻；(2)再用O. I 1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH為9 10. 5，然后升溫至60 70°C，并在60 70°C恒溫下反應(yīng)2. 5 3. 5小時后，將反應(yīng)物泵入抽濾機中，進行第一次抽濾，分別收集第一次抽濾渣和抽濾液；(3)對于收集的第一次抽濾渣，先用等體積的溫度為50 60°C熱蒸餾水反復(fù)進行洗滌2 4次，除去殘留的液體石蠟，分別收集洗滌液和洗滌后的濾渣,對于收集的洗滌液，先與收集的第一次抽濾液合并后，再泵人離心機中，在轉(zhuǎn)速為2000 4000轉(zhuǎn)/分下，進行離心分離，分別收集上層液體石蠟和下層清液，對于收集的上層液體石蠟，可再次用于分散殼聚糖溶液；對于收集的下層清液，經(jīng)生化處理達標(biāo)后排放；對于收集的洗滌后的濾渣，先加入3 6倍體積的體積濃度為2 5%的鹽酸溶液，在攪拌下溶解洗滌后濾渣中的碳酸鈣而形成混合液；然后將該混合液泵入抽濾機中，進行第二次抽濾，分別收集脫碳酸鈣濾過液和脫碳酸鈣濾渣；(4)將收集的脫碳酸鈣濾過液泵人蒸發(fā)器中，在80 100°C下，進行蒸發(fā)濃縮，回收氯化鈣濃縮液，可再利用；對于收集的脫碳酸鈣濾渣，先用蒸餾水反復(fù)進行洗滌至洗滌液的PH值為6. 5 7. 5為止，分別收集洗滌液和洗滌后的碳酸鈣濾渣，洗滌后的碳酸鈣濾渣即為制備出的交聯(lián)殼聚糖微球，對于洗滌液經(jīng)生化處理達標(biāo)后排放。3、制備接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂的步驟為(I)按第2步制備出的交聯(lián)殼聚糖微球中的游離氨基二環(huán)己基碳化二亞胺賴氨酸游離羧基的摩爾比為1:1 2:1 5的比例，先將第3 (4)步驟制備出的交聯(lián)殼聚糖微球加入賴氨酸的質(zhì)量濃度為O. 15 O. 25%的賴氨酸水溶液中，攪拌進行分散后,然后加入二環(huán)己基碳化二亞胺，在常溫下反應(yīng)10 50分鐘，反應(yīng)完成后進行抽濾，分別收集濾渣和濾液；(2)對于收集的濾液，含賴氨酸和二環(huán)己基碳化二亞胺，可再用于制備接枝殼聚糖賴氨酸樹脂；對于收集的濾渣，先用3 7倍的95%的乙醇溶液洗滌，除去二環(huán)己基碳化二亞胺衍生物，再進行抽濾，分別收集95%乙醇洗滌溶液和濾渣；(3)對收集的95%乙醇洗滌溶液，進行蒸餾回收乙醇；對收集的濾渣，裝入截留分子量為IOOODa 5000Da的透析袋中，對水透析過夜，除去殘存的賴氨酸，次日收集透析袋內(nèi)的球形顆粒，在60 80°C下進行干燥，直至恒重，即制備出交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹脂。4、制備交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹脂固定化肌酸激酶的步驟為(I)配制肌酸激酶緩沖溶液將肌酸激酶活性為1000U/g 10000U/g的肌酸激酶產(chǎn)品先用甘氨酸質(zhì)量濃度為0. 2mol/L的甘氨酸溶液溶解，在溶解時調(diào)節(jié)溫度為4 10°C，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為8 10，然后用I. O I. 5微米的微孔濾膜過濾,收集濾過液,就制備出肌酸激酶緩沖溶液，其中肌酸激酶活力為10 50U/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，用于制備固定化肌酸激酶；(2)將第3步制備出的交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹脂置于反應(yīng)器中，按照交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹脂的質(zhì)量第5 (I)步驟制備出的肌酸激酶緩沖溶液的體積比為1:50 100的比例，加入第5(1)步驟制備的肌酸激酶緩沖溶液，在攪拌下處理30 60分鐘；所述交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹脂的質(zhì)量按克來計量，肌酸激酶緩沖溶液的體積按毫升來計量；·(3)再按照交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹脂的質(zhì)量戊二醛體積分數(shù)5% 10%的戊二醛溶液的體積為I :5 10的比例，再加入戊二醛溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)0. 5 2小時，反應(yīng)完成后進行抽濾，分別收集濾渣和濾液；所述交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹脂的質(zhì)量按克來計量，戍二醒溶液的體積按暈升來計量；(4)對于收集的濾液，含本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種肌酸激酶固定化的方法，其特征在于：它以殼聚糖為原料，先制備出交聯(lián)殼聚糖溶液，再制備出交聯(lián)殼聚糖微球，然后制備出接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂，最后以接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂為載體固定化肌酸激酶。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種肌酸激酶固定化的方法，其特征在于它以殼聚糖為原料，先制備出交聯(lián)殼聚糖溶液，再制備出交聯(lián)殼聚糖微球，然后制備出接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂，最后以接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂為載體固定化肌酸激酶。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種肌酸激酶固定化的方法，其特征在于制備交聯(lián)殼聚糖溶液的步驟為 (O以殼聚糖為原料，按殼聚糖的質(zhì)量體積濃度為I 5%的鹽酸溶液的體積比為I :25 50的比例，將殼聚糖溶解于鹽酸溶液中，形成殼聚糖溶液；所述殼聚糖的質(zhì)量按克來計量，鹽酸溶液的體積按毫升來計量； (2)再在攪拌條件下在(I)步驟中加入等體積的液體石蠟進行分散，制備出液體石蠟分散的殼聚糖溶液； (3)然后按殼聚糖的質(zhì)量體積濃度為2.5% 5. 0%的雙縮水甘油醚溶液的體積比為I : 10 30的比例，在液體石蠟分散的殼聚糖溶液中加入雙縮水甘油醚溶液，進行交聯(lián)反應(yīng)20 30分鐘，就制備出交聯(lián)殼聚糖溶液；所述殼聚糖的質(zhì)量按克來計量，雙縮水甘油醚溶液的體積按暈升來計量。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種肌酸激酶固定化的方法，其特征在于制備交聯(lián)殼聚糖微球的步驟為 (1)將制備出的交聯(lián)殼聚糖溶液，先按致孔劑碳酸鈣殼聚糖的質(zhì)量比為I:1 3的比例，在交聯(lián)殼聚糖溶液中加入致孔劑碳酸鈣粉末，攪拌混合均勻； (2)再用O.I 1%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH為9 10. 5，然后升溫至60 70°C，并在60 70°C恒溫下反應(yīng)2. 5 3. 5小時后，將反應(yīng)物泵入抽濾機中，進行第一次抽濾，分別收集第一次抽濾渣和抽濾液； (3)對于收集的抽濾渣，先加入3 6倍體積的體積濃度為2 5%的鹽酸溶液，在攪拌下溶解洗滌后濾渣中的碳酸鈣而形成混合液；然后將該混合液泵入抽濾機中，進行第二次抽濾，分別收集脫碳酸鈣濾過液和脫碳酸鈣濾渣； (4)對于收集的脫碳酸鈣濾渣，先用蒸餾水反復(fù)進行洗滌至洗滌液的pH值為6.5 7. 5為止，分別收集洗滌液和洗滌后的碳酸鈣濾渣，洗滌后的碳酸鈣濾渣即為制備出的交聯(lián)殼聚糖微球。4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種肌酸激酶固定化的方法，其特征在于制備接枝賴氨酸交聯(lián)殼聚糖樹脂的步驟為 (1)按制備出的交聯(lián)殼聚糖微球中的游離氨基二環(huán)己基碳化二亞胺賴氨酸游離羧基的摩爾...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：毛先兵，周小華，蘇昱，陳真文，冉隆富，
申請(專利權(quán))人：西南藥業(yè)股份有限公司，重慶大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：