鈉/鉀離子比檢測方法、系統和試劑盒技術方案

本發明專利技術涉及鈉/鉀離子比檢測方法、系統和試劑盒。本發明專利技術涉及檢測鈉/鉀離子比濃度的方法，包括：（1）配制鈉/鉀比不同的多個溶液樣本，（2）將該多個溶液樣本置于熒光光譜儀下，檢測波長在第一、二波長處的熒光強度值，（3）獲得鈉/鉀離子比的標準曲線；（4）將待測液體樣品中加入帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子，并調節樣品pH值，從而得到測試溶液；（5）將測試溶液置于熒光光譜儀下，檢測波長在所述第一、二波長處的熒光強度值；（6）利用步驟（5）中測得的中測得的第一波長處的熒光強度值與第二波長處的熒光強度值的比值鈉/鉀離子比標準曲線中找到對應的測試溶液的鈉/鉀離子濃度比。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫藥領域，具體而言涉及ー種鈉/鉀離子比檢測方法、系統和試劑盒。
技術介紹
人體內的鈉、鉀離子是維持細胞生理活動的主要陽離子，是保持機體的正常滲透壓及酸堿平衡，參與糖及蛋白質代謝，保證神經肌肉的正常功能所必需，其含量是人體生理活動的重要指標。尿液、血清中鈉 、鉀離子的含量水平在臨床上可用了診斷ー些腎臟、心臟等方面的疾病。人體內的鈉鉀離子水平處于ー個平衡狀態，其比的改變對人體健康有著重要影響。對健康而言，監測鈉/鉀離子的比例可能比二者単獨的絕對數值更重要。在臨床上，通過檢測唾液鈉/鉀離子比，可診斷醛固酮增多癥。此外，美國學者近日研究證實24小時尿鈉/鉀離子比對心血管疾病風險的預測價值顯著優于單純的尿鈉或尿鉀檢測。由此可見，鈉/鉀離子比的監測對預防心血管疾病具重要意義。現有技術中測定鈉、鉀離子濃度的方法主要有中子活化法、同位素稀釋質譜法、化學測定法、火焰光度法、離子選擇電極法、酶動力學法、原子分光光度法等。目前，臨床上經常使用的方法是火焰光度法和離子選擇電極法。(I)火焰光度法火焰光度法是ー種發射光譜分析法，利用火焰中激發態原子回降至基態時發射的光譜強度進行含量分析，可檢測血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，該方法屬于經典的標準參考法，優點是結果準確可靠，廣為臨床采用。通常采用的定量方法有外標準法和內標準法。外標準法一般操作誤差較大，不常采用。內標法是標本及標準液采用加進相同濃度的內部標準元素進行測定，一般是加入鋰內標，測定的是鋰/鈉或鉀電流的比值，而不是単獨鈉或鉀的電流，這樣，可減小燃氣和火焰溫度波動等因素引起的誤差，因而有較好的準確性。(2)離子選擇電極法(ISE法):在專用儀器上進行血清和尿液的鉀、鈉離子測定。因其具有標本用量少，快速準確，操作簡便等優點，是目前所有方法中最為簡便準確的方法，幾乎有取代其他方法的趨勢。其原理是離子選擇電極是ー種電化學傳感器，其結構中有一個對特定離子具有選擇性響應的敏感膜電極，將離子活度轉換成電位信號，在一定范圍內，其電位與溶液中特定離子活度的對數呈線性關系，通過與已知離子濃度的溶液比較可求得未知溶液的離子活度，按其測定過程又分為直接測定法和間接測定法，目前大部分采用間接測定法，由于間接測定法將待測樣本稀釋后測定，所測離子活度更接近離子濃度。目前主要的電極種類有玻璃膜電極，感應材料為玻璃膜；固相電極，由難溶金屬物質加壓成型；液態膜電極，將環氧樹脂或內裝聚氯こ烯作為感應膜；纈氨霉素膜制成的K+電極。這些電極都具有一定壽命，使用一段時間后，電極會老化，且價格昂貴。(3)化學測定法目前Na+、K+的化學測定主要利用復環王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚，均為離子載體進行測定，由于大環結構內有空穴，分子內部氧原子有未共用電子對可與金屬離子結合，根據空穴大小，可選擇性結合不同直徑的金屬離子，從而可達到測出離子濃度的目的。(4)酶法酶法測定鉀的原理是利用鈉依賴的P -半乳糖苷酶催化人工底物ONPG(鄰硝基酚3 -D-吡喃半乳糖苷);分解釋放出有色產物鄰硝基酚，在波長420nm處測吸光度變化。酶法測鉀的原理是利用對丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸變為乳酸同時伴有還原型輔酶I的消耗，在波長340nm處測NADH的吸光度下降。酶法的優點是不需特殊儀器，缺點是價格較貴。(5)原子分光光度法也可用于檢測血清中鉀、鈉離子，但操作復雜，誤差較大，不及火焰光度法簡便。現有的這些方法都是分別測定鈉、鉀離子濃度，再在測出的數值基礎上計算鈉/鉀比。到目前為止，尚沒有直接測定鈉/鉀比的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的提供ー種利用鳥嘌呤四鏈體(G-四鏈體)熒光能量轉移體系檢測鈉/鉀離子比的新方法，以及應用該方法配制而成的鈉/鉀離子比檢測試劑盒。利用該試劑盒中的試劑，可利用熒光光譜儀器定量分析液體中鈉/鉀離子比，測定過程不受其他元素的影響，精確度高。本專利技術的總體技術路線為 通過加入帶有熒光標記基團的能夠形成鳥嘌呤-四鏈體(下文稱G-四鏈體)結構的DNA分子，該DNA分子因溶液中的鈉/鉀離子水平不同而產生不同構像，隨之影響DNA分子的熒光標記基團的能量轉移強度，從而反映出鈉/鉀離子的比水平。本專利技術的第一方面提供一種檢測液體樣品中鈉/鉀離子比的方法，所述方法包括以下步驟(I)用pH6. 2 8. 2的緩沖溶液和水溶性鈉鹽和鉀鹽配制鈉/鉀離子比不同的多個溶液樣本，其中每個所述溶液樣本中含有相同濃度的帶熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的的DNA分子；(2)將所述多個溶液樣本置于熒光光譜儀下，采用410nm至540nm的激發波長，檢測波長在第一、ニ波長處的突光強度值，其中所述第一波長在480nm至550nm范圍,所述第ニ波長在55 Inm至700nm范圍；(3)以各個所述溶液樣本的鈉/鉀離子比作為橫坐標或縱坐標，以步驟(2)中測得的第一波長處的熒光強度值與第二波長處的熒光強度值的比值為縱坐標或橫坐標作圖，從而獲得鈉/鉀離子比的標準曲線；(4)將待測液體樣品中加入所述帶有熒光標記基團的能夠形成G-四鏈體的DNA分子并調節PH值，以使待測液體樣品中的帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子的濃度以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液；(5)將步驟(4)中獲得的測試溶液置于熒光光譜儀下，采用410nm至540nm的激發波長，檢測波長在第一、ニ波長處的熒光強度值；(6)利用步驟(5)中測得的中測得的第一波長處的熒光強度值與第二波長處的熒光強度值的比值在步驟(3)中獲得的鈉/鉀離子比標準曲線中找到對應的測試溶液的鈉/鉀離子比。本專利技術的方法可以方便地用于檢測各種溶液樣品中的鈉/鉀離子比，例如，可以檢測人或動物血液、尿液、唾液或其他體液中的鈉/鉀離子比。根據本專利技術的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三こ醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、ニ(2—羥こ基)亞氨基三(羥甲基)甲烷-鹽酸緩沖液。根據本專利技術的方法，其中所述帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子中含有下式I的結構GGYGGZGGMGG式I其中Y、Z和M分別代表ー個或多個任意堿基；G代表鳥嘌呤堿基；所述熒光標記基團連接在所述DNA分子的兩端，并且連接在所述DNA分子兩端的熒光標記基團不同；連接在所述DNA分子兩端的熒光標記基團的組合選自以下熒光標記基團組合6_羧基熒光素(FAM)和6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)、異硫氰酸熒光素(FITC)和羅丹明(Rhodamine)、3H-吲哚菁染料(Cy3)和3H-吲哚菁染料(Cy5)或者Alexa488和3H-吲哚菁染料(Cy3)。根據本專利技術所述的方法，其中所述帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子條件下能夠形成不同G-四鏈體結構的DNA分子的堿基序列中優選具有“GG”結構。這類DNA分子中的堿基序列的非限定性實例包括，如 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、TGAGGGTGGGGAGG GTGGGGAA、A本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測液體樣品中鈉/鉀離子比的方法，所述方法包括以下步驟：（1）用pH6.2～8.2的緩沖溶液和水溶性鈉鹽和鉀鹽配制鈉/鉀比不同的多個溶液樣本，其中每個所述溶液樣本中含有相同濃度的帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G?四鏈體結構的DNA分子；（2）將所述多個溶液樣本置于熒光光譜儀下，采用410nm至540nm的激發波長，檢測波長在第一、二波長處的熒光強度值，其中所述第一波長在480nm至550nm范圍，所述第二波長在551nm至700nm范圍；（3）以所述溶液樣本的鈉/鉀比作為橫坐標或縱坐標，以步驟（2）中測得的第一波長處的熒光強度值與第二波長處的熒光強度值的比值為縱坐標或橫坐標作圖，從而獲得鈉/鉀離子比的標準曲線；（4）將待測液體樣品中加入所述帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G?四鏈體結構的DNA分子，并調節樣品的pH值以使待測液體樣品中的帶有熒光標記基團的能夠形成G?四鏈體的DNA分子的濃度以及pH值與步驟（1）中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液；（5）將步驟（4）中獲得的測試溶液置于熒光光譜儀下，采用與步驟（2）相同的激發波長，檢測波長在所述第一、二波長處的熒光強度值；（6）利用步驟（5）中測得的中測得的第一波長處的熒光強度值與第二波長處的熒光強度值的比值在步驟（3）中獲得的鈉/鉀離子比標準曲線中找到對應的測試溶液的鈉/鉀離子濃度比。...

【技術特征摘要】
1.一種檢測液體樣品中鈉/鉀離子比的方法，所述方法包括以下步驟 (1)用PH6.2 8. 2的緩沖溶液和水溶性鈉鹽和鉀鹽配制鈉/鉀比不同的多個溶液樣本，其中每個所述溶液樣本中含有相同濃度的帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子； (2)將所述多個溶液樣本置于熒光光譜儀下，采用410nm至540nm的激發波長，檢測波長在第一、二波長處的突光強度值，其中所述第一波長在480nm至550nm范圍,所述第二波長在551nm至700nm范圍； (3)以所述溶液樣本的鈉/鉀比作為橫坐標或縱坐標，以步驟(2)中測得的第一波長處的熒光強度值與第二波長處的熒光強度值的比值為縱坐標或橫坐標作圖，從而獲得鈉/鉀離子比的標準曲線； (4)將待測液體樣品中加入所述帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子，并調節樣品的pH值以使待測液體樣品中的帶有熒光標記基團的能夠形成G-四鏈體的DNA分子的濃度以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液； (5)將步驟(4)中獲得的測試溶液置于熒光光譜儀下，采用與步驟(2)相同的激發波長，檢測波長在所述第一、二波長處的熒光強度值； (6)利用步驟(5)中測得的中測得的第一波長處的熒光強度值與第二波長處的熒光強度值的比值在步驟(3)中獲得的鈉/鉀離子比標準曲線中找到對應的測試溶液的鈉/鉀離子濃度比。2.如權利要求1所述的方法，其中所述帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子中含有下式I的結構GGYGGZGGMGG 式I 其中式I中的X、Y、Z、和M、N分別代表一個或多個任意堿基而代表鳥嘌呤堿基；所述熒光標記基團連接在所述DNA分子的兩端，并且所述DNA分子兩端的熒光標記基團不同；連接在所述DNA分子兩端的熒光標記基團的組合選自以下熒光標記基團的組合6_羧基熒光素和6-羧基四甲基羅丹明、異硫氰酸熒光素和羅丹明、Cy3和Cy5或者Alexa488和Cy3。3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述帶有熒光標記基團的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子中的堿基序列為TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、T GAGGGTGGGGAGGGT GGGGAA、AGGGAGGGC GC T GGGAGGAGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、 GGTTGGTGTGGTTGG、 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、GGGCGCGGGAGGAAGG...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫紅霞，唐亞林，向俊鋒，楊千帆，管愛嬌，劉巖，
申請(專利權)人：中國科學院化學研究所，
類型：發明
國別省市：