基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法和裝置制造方法及圖紙

本發明專利技術公開了一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法，包括以下步驟：1)將圓偏振光作為激發光束，使用經渦旋位相編碼的圓偏振光作為抑制光束，所述激發光束和抑制光束通過大數值孔徑顯微物鏡聚焦并同時對熒光樣品進行掃描；2)利用所述大數值孔徑顯微物鏡收集掃描熒光樣品發出的熒光，并通過光電感應器件得到整幅熒光強度圖像；3)通過分析所述熒光強度圖像的熒光強度信息，得到相應的熒光壽命信息；4)設置時間門，對所述熒光壽命信息中的長壽命熒光圖像和短壽命熒光圖像進行分離；5)設置權值，用所述的短壽命熒光圖像減去加權的長壽命熒光圖像，得到最終的超分辨顯微圖像。本發明專利技術還公開了一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微裝置。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及顯微成像領域，尤其涉及一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法及>J-U ρ α裝直。
技術介紹
與絕大部分光學成像一樣，自從顯微鏡被專利技術以來，阿貝衍射極限也一直制約著顯微系統分辨率的提高。早期的顯微系統均為寬場成像系統，成像分辨能力有限。這一情況直到共聚焦顯微系統(Confocal Microscope)專利技術后才得到一定的改善。共聚焦顯微的基本概念在1957年由M. Minsky等人提出(參見M. Minsky等MicroscopyApparatus,美國專利3013467),但直到1978年該技術才真正得以儀器化(參見C. Cremer等 Considerationson a laser-scanning-microscope with high resolution and depthof field, MicroscopiaActa 81，31-44 (1978))。與傳統的寬場顯微系統相比，共聚焦顯微系統采用掃描成像的方式，在與成像物面共軛的焦平面上放置一個針孔(Pinhole)對非成像點周圍的雜散光進行遮擋，從而有效地限制了系統的有效點擴散函數。通過系統的光學傳遞函數分析可以證明，使用共聚焦方法，能夠在系統的極限分辨率提高約1. 4倍。近年來，隨著受激發射損耗顯微技術(Stimulated Emission Depletion(STED)microscopy)的提出(參見 S. W. Hell 等 Breaking the DiffractionResolution Limitby Stimulated-Emission-Stimulated-Emission-DepletionFluorescence Microscopy,Optics Letters 19，780-782 (1994))，遠場光學顯微成像的分辨率得到更大的改進，其分辨率被進一步推進達到納米量級，可以在活細胞上看到納米尺度的蛋白質，從而從物理上打破了衍射光學極限。其具體原理是基于傳統共焦顯微技術，對熒光標記進行熒光激發，與此同時用另一束高強度同軸 激光光束形成空心聚焦暗斑，對熒光標記周圍的衍射彌散發光進行抑制，這樣只有中心點的熒光激發現象可以被觀察到，從而打破衍射極限，達到超分辨顯微成像的目的。雖然STED顯微技術有效地提高了光學熒光顯微系統的成像分辨能力，但是由于其理論本身的限制，要求抑制光束的輸入光功率很高(通常達到W量級)，加大了熒光漂白和光毒作用的風險，容易對熒光樣品造成不可逆的損害，誤導觀察現象。為了降低抑制光束的光功率，Vicidomini等人在2011年提出了基于時間門技術的STED顯微術(time-gated STED, g-STED)(參見 G. Vicidomini 等 Sharper low-power STED nanoscopyby timegating, Nature Methods 8,571-573(2011))。該技術利用抑制光束照射突光樣品在抑制其受激熒光幅射的同時會縮短其熒光壽命的特點，在系統中設置時間門對熒光信號進行實時過濾，從而有效地將所需要的抑制光束輸入光功率降低到數十mW量級。但是，該種方法減少了可有效利用的熒光信號強度，降低了系統信噪比，容易對系統的實際分辨能力產生不利影響
技術實現思路
本專利技術提供了一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法和裝置，在保證低抑制光束輸入光功率的同時，提高系統的信噪比，從而提高系統的實際分辨能力。一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法，包括以下步驟I)將圓偏振光作為激發光束，使用經渦旋位相編碼的圓偏振光作為抑制光束，所述激發光束通過大數值孔徑顯微物鏡聚焦形成實心聚焦光斑，所述抑制光束通過所述大數值孔徑顯微物鏡聚焦形成空心聚焦光斑，兩光斑同時對熒光樣品進行掃描；2)利用所述大數值孔徑顯微物鏡收集掃描熒光樣品發出的熒光，并通過光電感應器件得到整幅熒光強度圖像；3)通過分析所述熒光強度圖像的熒光強度信息，得到相應的熒光壽命信息；4)設置時間門，對所述熒光壽命信息中的長壽命熒光圖像和短壽命熒光圖像進行分離；5)設置權值，用所述的短壽命熒光圖像減去加權的長壽命熒光圖像，得到最終的超分辨顯微圖像。步驟I)中所述的渦旋位相編碼是指對于一個橫截面中心對稱的圓形入射光束，以光束中心點為圓心，對橫截面內的光束產生O 2 的渦旋位相延遲，位相延遲量僅與截面內特定點的角向大小有關，而與該點到圓心的距離無關。可用如下公式加以表示本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法，其特征在于，包括以下步驟：1)將圓偏振光作為激發光束，使用經渦旋位相編碼的圓偏振光作為抑制光束，所述激發光束通過大數值孔徑顯微物鏡聚焦形成實心聚焦光斑，所述抑制光束通過所述大數值孔徑顯微物鏡聚焦形成空心聚焦光斑，兩光斑同時對熒光樣品進行掃描；2)利用所述大數值孔徑顯微物鏡收集掃描熒光樣品發出的熒光，并通過光電感應器件得到整幅熒光強度圖像；3)通過分析所述熒光強度圖像的熒光強度信息，得到相應的熒光壽命信息；4)設置時間門，對所述熒光壽命信息中的長壽命熒光圖像和短壽命熒光圖像進行分離；5)設置權值，用所述的短壽命熒光圖像減去加權的長壽命熒光圖像，得到最終的超分辨顯微圖像。

【技術特征摘要】
1.一種基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將圓偏振光作為激發光束，使用經渦旋位相編碼的圓偏振光作為抑制光束，所述激發光束通過大數值孔徑顯微物鏡聚焦形成實心聚焦光斑，所述抑制光束通過所述大數值孔徑顯微物鏡聚焦形成空心聚焦光斑，兩光斑同時對熒光樣品進行掃描； 2)利用所述大數值孔徑顯微物鏡收集掃描熒光樣品發出的熒光，并通過光電感應器件得到整幅熒光強度圖像； 3)通過分析所述熒光強度圖像的熒光強度信息，得到相應的熒光壽命信息； 4)設置時間門，對所述熒光壽命信息中的長壽命熒光圖像和短壽命熒光圖像進行分離； 5)設置權值，用所述的短壽命熒光圖像減去加權的長壽命熒光圖像，得到最終的超分辨顯微圖像。2.如權利要求1所述的基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法，其特征在于，所述激發光束的波長應位于所述突光樣品上的突光標記的突光吸收光譜帶內，所述抑制光束的波長應位于所述熒光樣品上的熒光標記的熒光發射光譜帶內，且所述抑制光束的波長應長于熒光發射峰值波長。3.如權利要求2所述的基于突光壽命差分的超分辨顯微方法,其特征在于,對所述突光強度信息通過時間相關單光子記數算法得到所述的熒光壽命信息。4.如權利要求3所述的基于熒光壽命差分的超分辨顯微方法，其...

【專利技術屬性】
技術研發人員：匡翠方，郝翔，李帥，顧兆泰，王軼凡，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：