冬蟲夏草dTMP激酶、編碼基因及其應用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與脫氧嘧啶核苷酸出發(fā)合成代謝二磷酸脫氧嘧啶核苷的酶，編碼這個酶的基因及其應用，所述酶即為dTMP激酶，具有SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列90%以上同源性，其編碼基因具有SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列90%以上同源性；本發(fā)明專利技術(shù)從原理上對脫氧嘧啶核苷酸合成二磷酸脫氧嘧啶核苷的代謝途徑進行了詳細研究，包含本發(fā)明專利技術(shù)所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過調(diào)節(jié)二磷酸脫氧嘧啶核苷生物合成基因的表達，賦予宿主二磷酸脫氧嘧啶核苷的高表達性，為擴大二磷酸脫氧嘧啶核苷的產(chǎn)量提供了有效途徑，具有重大應用前景。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與脫氧嘧啶核苷酸出發(fā)合成代謝二磷酸脫氧嘧啶核苷的dTMP激酶(dTMP kinase),以及編碼這個酶的基因及其應用。
技術(shù)介紹
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥。現(xiàn)代藥理學已證實，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內(nèi)外學者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發(fā)應用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲草具有嚴格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液，是解決冬蟲 夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發(fā)酵生產(chǎn)蟲草替代品，既可有效保護蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲草寄生條件嚴格的限制，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內(nèi)外一直致力于蟲草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產(chǎn)蟲草制品，以彌補自然資源的短缺，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產(chǎn)物的量均有明顯提聞。近年來，隨著天然產(chǎn)物化學和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，在對蟲草產(chǎn)品研發(fā)中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉(zhuǎn)向更深層次的功能性代謝產(chǎn)物研究。國內(nèi)外已對蟲草代謝產(chǎn)物做了大量的研究，代謝產(chǎn)物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產(chǎn)物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。核苷類是蟲草最主要的活性物質(zhì)之一，其中二磷酸脫氧嘧啶核苷類核苷包括胞二磷酸脫氧嘧啶核苷核苷和尿二磷酸脫氧嘧啶核苷核苷。尿二磷酸脫氧嘧啶核苷核苷(uracil riboside)又稱尿苷(ulidine),別稱由雪核糖苷、二氫二磷酸脫氧喃唳核苷核苷、1-β-D-喃核糖基尿二磷酸脫氧喃唳核苷。胞二磷酸脫氧喃唳核苷核苷(cytosineriboside)又名胞苷(cytidine)、胞唳、1-β-D-呋喃核苷胞二磷酸脫氧喃唳核苷。二磷酸脫氧嘧啶核苷核苷是多用途的核苷，可作為保健品和食品的添加劑。它作為美容和抗紫外輻射化妝品也逐漸成為人們生活的必需品，作為藥物，已臨床應用于中樞神經(jīng)、泌尿、代謝和心血管等多方面的疾病，在美國，核酸類藥品近年來在抗病毒、抗腫瘤方面顯示了不可替代的作用。由于嘧啶核苷及其類似物的重要生理作用，國內(nèi)外有關(guān)微生物生產(chǎn)嘧啶類核苷已有很多研究。然而作為重要合成代謝嘧啶類核苷的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產(chǎn)物成分分析和功效的研究上，對冬蟲夏草菌嘧啶類核苷合成代謝途徑中相關(guān)基因和蛋白的研究還很少見。·
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問題，對“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢合成代謝二磷酸脫氧嘧啶核苷的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與脫氧嘧啶核苷酸出發(fā)合成代謝二磷酸脫氧嘧啶核苷的酶、編碼基因及其應用。本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是本專利技術(shù)涉及一種來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與脫氧嘧啶核苷酸出發(fā)合成代謝二磷酸脫氧嘧啶核苷的dTMP激酶，所述酶具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列90%以上同源性，優(yōu)選其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(記為pynR蛋白)；該酶可催化脫氧嘧啶核苷酸制備二磷酸脫氧嘧啶核苷。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本專利技術(shù)保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。由脫氧嘧啶核苷酸合成代謝獲得二磷酸脫氧嘧啶核苷的路徑如下式所示本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種冬蟲夏草dTMP激酶，其特征在于所述酶具有SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列90%以上同源性。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種冬蟲夏草dTMP激酶，其特征在于所述酶具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列90%以上同源性。2.如權(quán)利要求1所述冬蟲夏草dTMP激酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列為SEQIDNo.1所示。3.如權(quán)利要求1所述冬蟲夏草dTMP激酶在生物催化脫氧嘧啶核苷酸制備二磷酸脫氧嘧啶核苷中的應用。4.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述的應用為以含冬蟲夏草dTMP激酶菌體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)細胞破碎后的破碎混合液為催化劑，以脫氧嘧啶核苷酸為底物，于pH為6. 5^8. 5的緩沖溶液構(gòu)成的轉(zhuǎn)化體系中，在30°C、150rpm條件下轉(zhuǎn)化反應2 3h，反應結(jié)束后，將反應液過濾，取濾液即為含二磷酸脫氧嘧啶核苷的粗品，所述粗品分離純化獲得二磷酸脫氧嘧啶核苷。5.如權(quán)利要求3所述的應...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭裕國，柳志強，吳暉，李邦良，許靜，吳玲芳，許峰，薛亞平，袁水金，王鴻艷，
申請(專利權(quán))人：浙江工業(yè)大學，杭州中美華東制藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：