本發(fā)明專利技術涉及生物芯片領域，具體地涉及一種以發(fā)夾式DNA為探針的可視化塑料基生物芯片及其制備和使用方法。所述生物芯片包括以下特征：1）透明的塑料基片；2）固定在上述基片上的具有發(fā)夾構型且內(nèi)嵌信號報道基團的DNA信標探針；3）當該芯片與靶標物接觸時,靶標物能誘導DNA探針發(fā)生構型轉變，從而產(chǎn)生響應信號。該型生物芯片以塑料基片為固體載片，以比色檢測法為芯片信號的讀出方法，不需在檢測過程中額外加入信號報道分子；因此該型生物芯片具備成本低廉、應用便以及靈敏度高等優(yōu)點，是實施現(xiàn)場快速檢測與分析的理想工具。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及生物芯片領域，具體地涉及一種以發(fā)夾式DNA為探針的可視化塑料基生物芯片及其制備方法和應用。
技術介紹
目前已開發(fā)的生物芯片大多是將探針分子固定在玻片或硅片等基片上，或是利用探針分子去捕獲標記過的靶標物，或是在捕獲無標記的靶標物之后再額外加入信號報道單元(即形成夾心式的傳感構型)(例如J. Am. Chem. Soc. 2001，123:5194-5205.)，來實現(xiàn)對靶標物的信號響應。然而，無論是采用標記靶標物，還是采用額外加入信號報道單元，均增加了生物芯片在操作過程中的復雜性和對專業(yè)儀器的依賴性，大大降低了生物芯片的可實用性。把所有修飾以及信號單元都集中在探針分子上，即采用分子信標(經(jīng)功能單元修飾的探針分子)作為探針，是實現(xiàn)對靶標物便捷、靈敏檢測的一種可行性途徑。分子信標(beacon)通常是指一段具有特殊堿基序列的雙標記核苷酸鏈(DNA)， 由于其鏈兩端的堿基序列互補配對，從而形成莖環(huán)相連的發(fā)夾狀結構(hairpin) (Nat. Biotechnol.，1996，14:303-308.)。通常在分子信標一端修飾上熒光基團，另一端修飾上熒光猝滅基團。當DNA呈發(fā)夾狀折疊時，兩端修飾基團相距較近，發(fā)生熒光猝滅而沒有信號； 當加入靶標物后，分子信標構型發(fā)生翻轉即發(fā)夾結構被打開，熒光基團與猝滅基團距離變遠，從而產(chǎn)生熒光信號。相對于傳統(tǒng)的直鏈DNA探針，分子信標以操作簡單、無需對靶標物標記、靈敏度高等特點，在液相生物分析與檢測領域得到了廣泛的應用。盡管如此，將分子信標固定在塑料基片上，利用其與靶標物的特異性結合來誘導構型轉變，進而實現(xiàn)對靶標物的可視化靈敏檢測，仍然存在諸多挑戰(zhàn)。如要兼顧探針發(fā)夾結構的穩(wěn)定性和探針中功能片段與靶標物的結合強度，還需兼顧信號標記單元在探針構型翻轉前后與基片間距離的遠近。其次，分子信標探針在塑料基片上的密度、其構型的穩(wěn)定性 (與溫度及緩沖液鹽離子濃度等有關)也需要系統(tǒng)研究與反復的優(yōu)化。再次，針對不同靶標物，為了降低背景信號，需要優(yōu)化信號單元與探針鏈間的連接長度和選擇合適的封閉溶液。 目前，將分子信標固定在塑料基片表面上進行可視化的分析與檢測尚未見報道。
技術實現(xiàn)思路
因此，本專利技術的目的是提供一種以發(fā)夾式DNA為探針的可視化塑料基生物芯片。本專利技術的再一目的是提供一種發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片的制備方法。本專利技術的再一目的是提供一種應用發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片的應用。進行分子信標的研究和應用時，莖干區(qū)和環(huán)狀區(qū)的序列設計是關鍵所在。過長的莖干會使發(fā)夾結構過于穩(wěn)定而給出假陰性結果，過短則使發(fā)夾結構不穩(wěn)定，容易給出假陽性結果。就序列堿基來說，應該使莖干區(qū)穩(wěn)定狀態(tài)適當，而環(huán)狀區(qū)則應該避免任何可能的二級結 構，否則分子信標莖一環(huán)結構將受到影響。在本專利技術中我們主要對探針末端(生物素修飾的一端)鏈長、分子信標探針莖干區(qū)互補配對的堿基個數(shù)進行了優(yōu)化。此外，分子信標探針的濃度，緩沖液的PH值、鎂離子的濃度，封閉液、封閉液的濃度對分子信標探針的固定、發(fā)夾結構的形成、背景信號的降低和目標信號的增強有重要的影響。本專利技術中我們主要對分子信標探針的濃度、首次封閉液和封閉液的濃度進行了優(yōu)化。根據(jù)本專利技術的發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片包括1)透明的塑料基片(PC，PMMA，PET等)；2)固定在上述基片上呈陣列分布的DNA信標探針(hairpin DNA);所述分子信標探針是一種呈發(fā)夾結構的雙標記核苷酸鏈，其一端修飾聯(lián)接基團(例如，氨基、羥基、醛基等)以固定在基片上，其中聯(lián)接基團與探針鏈通過6-12碳的烷基鏈相連；另一端修飾信號報道基團，其中探針鏈端與信號報道基團通過6-18碳的烷基鏈相連，以顯示識別反應的發(fā)生；另外，探針鏈兩端部分堿基(5-10對)互補配對以形成莖(stem)-環(huán)(loop)相連的發(fā)夾構型。當該型芯片與靶標物(target)接觸時，靶標物能誘導DNA探針發(fā)生構型轉變，從而產(chǎn)生響應信號。若該型芯片生物芯片進一步遭受銀染色或酶催化底物顯影處理，即可獲得可視化的目標信號。根據(jù)本專利技術的發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片，所述信號報道基團為金納米粒子或鉬納米粒子(l_20nm)、生物素、酶(例如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AKP)以及葡萄糖氧化酶(GOD))等。根據(jù)本專利技術的發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片的制備方法包括以下步驟I)塑料基片表面活化處理；通過光學或化學方法在基片表面產(chǎn)生高密度活性基團 (例如羧基、巰基、羥基、醛基、氨基等);2)分子信標探針的固定，所述分子信標探針是一種呈發(fā)夾結構的雙標記核苷酸鏈，其一端修飾聯(lián)接基團(例如，氨基、羥基、醛基等)以固定在基片上，其中聯(lián)接基團與探針鏈通過6-12碳的烷基鏈相連；另一端修飾信號報道基團(例如，金或鉬納米粒子米粒子、生物素、酶等)，其中探針鏈端與信號報道基團通過6-18碳的烷基鏈相連，以顯示識別反應的發(fā)生；另外，探針鏈兩端部分堿基(5-10對)互補配對以形成莖(stem)-環(huán)(loop)相連的發(fā)夾構型；3)基片的首次封閉，加入封閉型溶液(例如，20mM磷酸鹽+150mM NaCl+2%BSA, pH=7. 4的緩沖溶液)到固定分子信標探針的芯片中封閉2小時；然后沖洗基片表面，并吹干待用。本專利技術的發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片的可以用于檢測重金屬離子(Hg2+，Pb2+等)、 活性蛋白質(zhì)、活性小分子、特定序列的DNA，其檢測步驟如下1)靶標物的捕獲，將含有靶標物的樣品溶液引入到首次使用的塑料芯片表面，或將首次使用的芯片插入含有靶標物的樣品溶液中浸泡廣2小時，使靶標物與信標探針充分結合，再清洗、吹干待用；2)基片的二次封閉在芯片顯影處理之前，需將其浸沒入封閉型溶液(例如，20mM 磷酸鹽+0. 1%明膠+0. 1%吐溫20，pH=7. 4)，然后沖洗芯片，吹干待用；3)芯片顯影 處理將顯影液(可溶性銀鹽與還原劑組成的混合液或含底物的緩沖液(例如四甲基聯(lián)苯胺一 TMB))滴加到基片表面固定有靶標分子的區(qū)域，然后，每十分鐘更換一次顯影液直至在基片表面出現(xiàn)明顯信號點或信號線。4)芯片檢測結果的定性和定量分析依據(jù)目測或者采用普通的成像或透照工具 (例如數(shù)碼照相機、平板掃描儀、膠片閱片器等)對芯片檢測結果進行定性或定量分析。根據(jù)本專利技術的具體實施方式，發(fā)夾式DNA新型塑料基生物芯片包括I)透明的塑料基片(PC，PMMA, PET等)；2)固定在上述塑料基片上的分子信標探針(hairpin probe)0所述分子信標是一種呈發(fā)夾結構的雙標記核苷酸探針，其一端修飾聯(lián)接基團以固定在基片上，另一端修飾信號報道單元(金納米粒子、生物素、酶等小分子等)以顯示識別反應的發(fā)生；另外探針兩端部分堿基序列互補配對。在正常情況下，當靶標物不出現(xiàn)的時候，分子信標探針呈莖環(huán)相連的發(fā)夾狀構型(即探針處于“閉環(huán)狀態(tài)“)，信號水平很低(如圖-1所示)。3)靶標物(target)的出現(xiàn)會引起固定在基片上分子信標探針構型的轉變，從而產(chǎn)生可視化信號響應。當加入靶標物后，分子信標探針與靶標物特異性結合，分子信標探針的構型發(fā)生翻轉，發(fā)夾結構被打開，形成比分子信標的莖環(huán)結構更穩(wěn)定的雙鏈體、四鏈體等構型(即探針處于“開環(huán)狀態(tài)“)。此時信號單元(金納米粒子、生物素、酶等)與塑料基片間的距離發(fā)生明顯改變，而這本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片，其特征在于，1）透明的塑料基片；2）固定在上述基片上呈陣列分布的DNA信標探針，所述分子信標探針是一種呈發(fā)夾結構的雙標記核苷酸鏈，其一端修飾聯(lián)接基團以固定在基片上，其中聯(lián)接基團與探針鏈通過6?12碳的烷基鏈相連，另一端修飾信號報道基團，其中探針鏈端與信號報道基團通過6?18碳的烷基鏈相連，以顯示識別反應的發(fā)生；另外，探針鏈兩端5?10對堿基互補配對以形成莖–環(huán)相連的發(fā)夾構型。
【技術特征摘要】
1.一種發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片，其特征在于，1)透明的塑料基片；2)固定在上述基片上呈陣列分布的DNA信標探針，所述分子信標探針是一種呈發(fā)夾結構的雙標記核苷酸鏈，其一端修飾聯(lián)接基團以固定在基片上，其中聯(lián)接基團與探針鏈通過6-12碳的烷基鏈相連，另一端修飾信號報道基團，其中探針鏈端與信號報道基團通過6-18 碳的烷基鏈相連，以顯示識別反應的發(fā)生；另外，探針鏈兩端5-10對堿基互補配對以形成莖-環(huán)相連的發(fā)夾構型。2.根據(jù)權利要求1所述的發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片，其特征在于，所述信號報道基團為金納米粒子或鉬納米粒子，粒徑為l_20nm ;生物素；酶；或葡萄糖氧化酶。3.一種發(fā)夾式DNA塑料基生物芯片的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)塑料基片表面活化處...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：李運超，時曉利，
申請(專利權)人：北京師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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