一種黃芩毛狀根保藏和復壯方法技術

本發明專利技術公開了一種黃芩毛狀根的保藏和復壯方法，屬于植物細胞保藏技術領域，本發明專利技術的技術方案主要包括以下步驟：將經挑選的黃芩毛狀根根尖部在液體培養基中避光培養至對數生長期；挑選經液體培養得到的黃芩毛狀根，加入保藏培養基中，室溫下，避光靜置保藏；取保藏培養的黃芩毛狀根，接種到活化培養基中，避光培養20～25d；取活化后的黃芩毛狀根，接入復壯培養基，25～28℃避光培養15～20d。本發明專利技術提供的保藏和復壯方法成本低廉，操作簡便，解決了液氮保藏專業性要求高、費用大和常規冷藏保藏操作過于繁瑣的問題。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于植物細胞保藏
，涉及ー種黃芩毛狀根的保藏和復壯方法。
技術介紹
植物細胞保藏技術是生產和研究的基礎，其原理是通過人工方法使細胞進入休眠狀態，降低其生長代謝活動，達到抑制細胞增殖和減少變異的目的。常用的植物細胞保藏方法有液氮超低溫保藏法和低溫冷蔵法液氮保藏需專用器具、成本高，一般只在專業保藏機構中使用；實驗室多采用低溫冷蔵法保藏植物細胞，但保存過程會因代謝產物累積而改變其生存環境，一般I 4個月須重新進行轉接保藏，雖不需特殊設備，但煩瑣費吋，故僅限于短期保藏，且經常移植容易弓I起細胞退化。黃岑(Scutellariabaicalensis Georgi),為唇形科(Labiatae)植物，其藥用部位為黃芩干燥根，性寒、味苦，歸肺、心、肝、膽、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效。黃芩主要分布于河北、遼寧、陜西、山東、內蒙古等地，主要成分是黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩酮1、黃芩酮I1、千層紙黃素A及菜油留醇等。近年來，研究發現其主要有效成分黃芩苷有抗HIV、抗腫瘤、抗氧化及清除氧自由基等作用，隨著新藥不斷開發，黃芩用量在迅速増加，黃芩資源的可持續發展問題日顯重要。毛狀根培養技術是20世紀80年代后期在植物細胞領域發展起來的一項新技木，與一般的植物細胞培養相比，毛狀根可以生長在不含激素的培養基上。在誘導出毛狀根的基礎上，結合細胞培養技術建立起毛狀根培養系統。這ー培養系統對傳統藥材來說很重要，因為約1/3的傳統中藥材是植物的根部，曾經被認為難以通過細胞培養來生產的許多源于植物根部的藥物，現在正被設法通過培養毛狀根來生產。毛狀根培養遵循一般的生長模式，代謝產物不一定是生長相關的，但是毛狀根的遺傳性能和次級代謝產物合成能力比較穩定，為進行毛狀根的高密度培養創造了較好的有利條件。因此，毛狀根培養技術已被認為是生產藥用植物次生代謝產物的一條重要途徑，具有非常廣泛的應用前景。
技術實現思路
本專利技術解決的問題在于提供一種黃芩毛狀根的保藏和復壯方法，通過對保藏和復壯條件的優化，實現了黃芩優良毛狀根株系的保存。本專利技術是通過以下技術方案來實現—種黃芩毛狀根的保藏和復壯方法，包括以下步驟I)挑選處于對數生長期的黃芩毛狀根，接種入保藏培養基中，室溫下，避光靜置保藏；所述的保藏培養基pH為5. 5 6. 5,包括I 4g じ1鹿糖、0. 5 2. Omg じ1甘氨酸、0.5 1. Omg じ1鹽酸硫胺素、0.1 0. 5mg じ1鹽酸批P多醇、0.1 1. Omg じ1煙酸和10 IOOmg じ1肌醇，以及無機鹽部分；2)取保藏培養的黃芩毛狀根，接種到活化培養基中，在25 28°C、避光震蕩或搖瓶培養20 25天；所述的活化培養基 pH為5. 5 6. 5，包括10 30g じ1蔗糖、100 500mg じ1水解乳蛋白、0. 5 2. Omg じ1甘氨酸、0. 5 1. Omg じ1鹽酸硫胺素、0.1 0.5mg じ1鹽酸卩比卩多醇、0.1 1. Omg じ1煙酸和10 IOOmg じ1肌醇，以及無機鹽部分；3)取活化后的黃芩毛狀根，接種入復壯培養基中，在25 28°C、避光震蕩或搖瓶培養20 25天；所述的復壯培養基pH為5. 5 6. 5，包括0.1 0. 4mmol じ1苯丙氨酸、30 60g じ1葡萄糖、500 IOOOmg じ1水解乳蛋白、1. 0 4. Omg じ1甘氨酸、0. 5 2.5mg じ1鹽酸硫胺素、0. 5 1. 5mg じ1鹽酸卩比卩多醇、0. 5 2. Omg じ1煙酸和50 200mg じ1肌醇，以及無機鹽部分；所述的無機鹽部分包括50 150mg L-1KH2PO4^OO 2000mg じ1KNO3UOO 300mg じ1MgSO4 7H20、200 500mg じ1CaCl2 2H20、10 30mg じ1Na2EDTA 2H20、I 5mg [1H3BO3J 20mg じ1FeSO4 7H20、0. 01 0. 05mg じ1CuSO4 5H20、2 IOmg じ1 ZnSO4 7H20、0.1 0. 5mg じ1Na2MoO4 2H20、0. 01 0. 05mg じ1CoCl2 6H20、0.2 0. 5mg じ1KI 和 5 20mg じ1MnSO4 4H20。所述的對數生長期的黃芩毛狀根的獲得為將挑選的黃芩毛狀根的根尖部，接種入液體培養基，在25 28°C、避光震蕩或搖瓶培養至對數生長期；所述的液體培養基pH為5. 5 6. 5，包括30 50g じ1蔗糖，300 IOOOmg じ1水解乳蛋白，0. 5 4. Omg じ1甘氨酸、0. 5 2. 5mg じ1鹽酸硫胺素、0. 5 1.5mg じ1鹽酸卩比卩多醇、0. 5 2. Omg じ1煙酸和50 200mg じ1肌醇，以及無機鹽部分。所述挑選是選取毛狀根生物量和黃芩苷含量高的株系，在無菌條件下挑取色淺、根系直、分枝多且根表面微絨毛明顯的黃芩毛狀根根尖部，挑取部位包含I 5個生長點，分枝長度0. 2 1. 0cm。所述將黃芩毛狀根的根尖部以0. 5 0. 8%的接種量接入液體培養基，IlOr min'25 28°C避光培養15 20天至對數生長期。所述取活力旺盛、同步生長、處于對數生長期的黃芩毛狀根，按0. 5 0. 8%的接種量接種入保藏培養基中，于24 26°C避光，靜置保藏5 18個月。所述取保藏培養的黃芩毛狀根，按0. 2 0. 6%的接種量接種到活化培養基中后，在 25 28°C、110r mirT1 下培養 20 25 天。所述在活化后的黃芩毛狀根新鮮根部位挑取色淺、根系直，包含I 5個生長點，分枝長度0. 2^0. 5cm的根尖部黃芩毛狀根，按0. 2 0. 6%的接種量接種到復壯培養基中后，在25 28°C、110r mirT1下培養20 25天。所述取復壯后的黃芩毛狀根作為種子，接種入用于生產黃芩苷的培養基中，在25 28°C、避光震蕩或搖瓶培養35 50天生產黃芩苷。所述用于生產黃岑苷的培養基pH為5. 5 6. 5,包括0.1 0. 4mmol じ1苯丙氨酸、30 60g じ1鹿糖、500 IOOOmg じ1水解乳蛋白、1. 0 4. Omg じ1甘氨酸、0. 5 2.5mg じ1鹽酸硫胺素、0. 5 1. 5mg じ1鹽酸卩比卩多醇、0. 5 2. Omg じ1煙酸和50 200mg じ1肌醇，以及無機鹽部分。—種黃岑毛狀根的室溫保藏培養基,該培養基pH為5. 5 6. 5,包括I 4g L 1鹿糖、0. 5 2. Omg じ1甘氨酸、0. 5 1. Omg じ1鹽酸硫胺素、0.1 0. 5mg じ1鹽酸卩比ロ多醇、0.1 1. Omg じ1煙酸和10 IOOmg じ1肌醇，以及無機鹽部分。所述的無機鹽部分包括50 150mg L-1KH2PO4^OO 2000mg じ1KNO3、100 300mg じ1MgSO4 7H20、200 500mg じ1CaCl2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種黃芩毛狀根的保藏和復壯方法，其特征在于，包括以下步驟：1）挑選處于對數生長期的黃芩毛狀根，接種入保藏培養基中，室溫下，避光靜置保藏；所述的保藏培養基pH為5.5～6.5，包括1～4g·L?1蔗糖、0.5～2.0mg·L?1甘氨酸、0.5～1.0mg·L?1鹽酸硫胺素、0.1～0.5mg·L?1鹽酸吡哆醇、0.1～1.0mg·L?1煙酸和10～100mg·L?1肌醇，以及無機鹽部分；2）取保藏培養的黃芩毛狀根，接種到活化培養基中，在25～28℃、避光震蕩或搖瓶培養20～25天；所述的活化培養基pH為5.5～6.5，包括10～30g·L?1蔗糖、100～500mg·L?1水解乳蛋白、0.5～2.0mg·L?1甘氨酸、0.5～1.0mg·L?1鹽酸硫胺素、0.1～0.5mg·L?1鹽酸吡哆醇、0.1～1.0mg·L?1煙酸和10～100mg·L?1肌醇，以及無機鹽部分；3）取活化后的黃芩毛狀根，接種入復壯培養基中，在25～28℃、避光震蕩或搖瓶培養20～25天；所述的復壯培養基pH為5.5～6.5，包括0.1～0.4mmol·L?1苯丙氨酸、30～60g·L?1葡萄糖、500～1000mg·L?1水解乳蛋白、1.0～4.0mg·L?1甘氨酸、0.5～2.5mg·L?1鹽酸硫胺素、0.5～1.5mg·L?1鹽酸吡哆醇、0.5～2.0mg·L?1煙酸和50～200mg·L?1肌醇，以及無機鹽部分；所述的無機鹽部分包括：50～150mg·L?1KH2PO4、500～2000mg·L?1KNO3、100～300mg·L?1MgSO4·7H2O、200～500mg·L?1CaCl2·2H2O、10～30mg·L?1Na2EDTA·2H2O、1～5mg·L?1H3BO3、5～20mg·L?1FeSO4·7H2O、0.01～0.05mg·L?1CuSO4·5H2O、2～10mg·L?1ZnSO4·7H2O、0.1～0.5mg·L?1Na2MoO4·2H2O、0.01～0.05mg·L?1CoCl2·6H2O、0.2～0.5mg·L?1KI和5～20mg·L?1MnSO4·4H2O。...

【技術特征摘要】
1.一種黃芩毛狀根的保藏和復壯方法，其特征在于，包括以下步驟 1)挑選處于對數生長期的黃芩毛狀根，接種入保藏培養基中，室溫下，避光靜置保藏；所述的保藏培養基pH為5. 5 6. 5,包括I 4g · L-1鹿糖、O. 5 2. Omg · L-1甘氨酸、O.5 1. Omg *L_1鹽酸硫胺素、O.1 O. 5mg *L_1鹽酸批卩多醇、O.1 1. Omg *L_1煙酸和10 IOOmg · L-1肌醇，以及無機鹽部分； 2)取保藏培養的黃芩毛狀根，接種到活化培養基中，在25 28°C、避光震蕩或搖瓶培養20 25天；所述的活化培養基pH為5. 5 6. 5，包括10 30g Γ1蔗糖、100 500mg Γ1水解乳蛋白、O. 5 2. Omg · L—1甘氨酸、O. 5 1. Omg · L—1鹽酸硫胺素、O.1 O. 5mg · L—1鹽酸批卩多醇、O.1 1. Omg · L-1煙酸和10 IOOmg · L-1肌醇，以及無機鹽部分； 3)取活化后的黃芩毛狀根，接種入復壯培養基中，在25 28°C、避光震蕩或搖瓶培養20 25天；所述的復壯培養基pH為5. 5 6. 5，包括O.1 O. 4mmol Γ1苯丙氨酸、30 60g *L_1 葡萄糖、500 IOOOmg *L_1 水解乳蛋白、1. O 4. Omg *L_1 甘氨酸、O. 5 2. 5mg *L_1鹽酸硫胺素、O. 5 1. 5mg · L—1鹽酸批B多醇、O. 5 2. Omg · L—1煙酸和50 200mg · L—1肌醇，以及無機鹽部分； 所述的無機鹽部分包括50 150mg · L-1KH2PO4^OO 2000mg · T1KNO3UOO 300mg · IZ1MgSO4 · 7H20、200 500mg · IZ1CaCl2 · 2H20、10 30mg · IZ1Na2EDTA · 2H20、I 5mg · IZ1H3BO3J 20mg · IZ1FeSO4 · 7Η20、0· 01 O. 05mg · !/1CuSO4 · 5H20、2 IOmg · T1ZnSO4 · 7Η20、0· I O. 5mg · L^1Na2MoO4 · 2Η20、0· 01 0. 05mg · T1CoCl2 · 6H20、0.2 0. 5mg · L-1KI 和 5 20mg · L-1MnSO4 · 4H20。2.如權利要求1所述的黃芩毛狀根的保藏和復壯方法，其特征在于，所述的對數生長期的黃芩毛狀根的獲得為 將挑選的黃芩毛狀根的根尖部，接種入液體培養基，在25 28°C、避光震蕩或搖瓶培養至對數生長期；所述的液體培養基pH為5. 5 6. 5，包括30 50g · Γ1蔗糖，300 IOOOmg · L—1水解乳蛋白，O. 5 4. Omg · L—1甘氨酸、O. 5 2. 5mg · L—1鹽酸硫胺素、O. 5 1.5mg · L-1鹽酸批B多醇、O. 5 2. Omg · L-1煙酸和50 200mg · L-1肌醇，以及無機鹽部分。3.如權利要求2所述的黃芩毛狀根的保藏和復壯方法，其特征在于，所述挑選是選取毛狀根生物量和黃芩苷含量高的株系，在無菌條...

【專利技術屬性】
技術研發人員：施春陽，齊香君，錢衛東，李雅，
申請(專利權)人：陜西科技大學，
類型：發明
國別省市：