誘導天然四倍體泥鰍雌核發育的方法技術

本發明專利技術公開一種操作方法簡單、快捷，無需卵子染色體加倍處理的誘導天然四倍體泥鰍雌核發育的方法，依次按如下步驟進行：a.取天然雌性四倍體泥鰍及雄性二倍體泥鰍進行催產，分別取雌性四倍體泥鰍的卵子及雄性二倍體泥鰍的精液，所得精液用Kurokura’ssolution溶液100倍稀釋待用；b.將二倍體泥鰍精液均勻鋪設于底面涂有厚度為1mm的1%BSA潔凈培養皿內，用紫外線照射二倍體泥鰍的精液，照射劑量為50erg/mm?/s×120s；c.取a步驟所得卵子與經b步驟紫外線照射的二倍體泥鰍的精子授精，授精在避光條件下進行，并在避光狀態中孵化15min；d.受精卵孵化及培育。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種多倍體魚類雌核發育的方法，尤其是一種操作方法簡單、快捷，無需卵子染色體加倍處理，可快速、高效生產雌核發育二倍體泥鰍的。
技術介紹
人工誘導雌核發育(artificially induced gynogenesis)是通過物理或化學方法使遺傳失活的精子激活卵，精子不參與合子核的形成，卵僅靠雌核發育形成胚胎并經過染色體加倍發育成正常個體的技術。到目前為止，國內外先后對斑馬魚(Zfeflio rerio) >青鎌魚(Oryzias、香魚(Plecoglossus alti velis 入大麻哈魚(Oncorhynchusrhodurus )、虹轉(VncorAyncAus mykiss)、羅車魚(Oreochromis、非洲鲇魚(Clarias 褐牙鲆 iParalichthys oilvaceus)、漠斑牙鲆{Paralichthyslethostigma)、大黃魚{Pseudosciaena crocea,Larimichthys crocea)、細鱗大麻哈jk iOncorhynchus gorbuscha)等進行了雌核發育誘導。人工誘導雌核發育是一種實用性較強的科學手段，在產生純系、染色體操作、遺傳分析以及性別控制等方面都有潛在的應用價值?！つ壳?，人工誘導魚類雌核發育二倍體包括兩個關鍵步驟(I)精子染色體的遺傳失活；(2)卵子染色體的二倍體化。前者主要用來激活卵子發育；后者是使受精卵恢復正常二倍體倍性以來保證個體的正常發育。現有卵子染色體的二倍體化主要有物理學方法、化學方法和生物學方法三種，無論哪種方法，在多倍體誘導過程中的各種處理(如物理操作或藥物殘留)對細胞內特定蛋白的生化效應存在一定的傷害，這種傷害常常對誘導物的生長和存活產生一定的負面效應。
技術實現思路
本專利技術是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作方法簡單、快捷，無需卵子染色體加倍處理，可快速、高效生產雌核發育二倍體泥鰍的誘導天然四倍體魚類雌核發育的方法。本專利技術的技術解決方案是一種，其特征在于依次按如下步驟進行 a.精、卵的獲得 取天然雌性四倍體泥鰍及雄性二倍體泥鰍進行催產，分別取雌性四倍體泥鰍的卵子及雄性二倍體泥鰍的精液，所得精液用Kurokura’ s solution溶液稀釋100倍待用； b.精子的遺傳失活 將二倍體泥鰍精液均勻鋪設于底面涂有厚度為Imm的1%BSA潔凈培養皿內，用紫外線照射二倍體泥鰍的精液，照射劑量為50erg/mm2/SX120S ； c.人工授精取a步驟所得卵子與經b步驟紫外線照射的二倍體泥鰍的精子授精，授精在避光條件下進行，并在避光狀態中孵化15min ；d.受精卵孵化及培育 將所得受精卵收集在裝有淡水的培養皿中孵化，水溫23± 1°C，每天換水兩次，每次換水1/3，待孵化后移入另一培育器皿培育，生產出泥鰍雌核發育二倍體魚苗。本專利技術是以經紫外線滅活的二倍體泥鰍的精子激活天然四倍體泥鰍的卵子，繼而培育出雌核發育二倍體泥鰍。因天然四倍體泥鰍是含有四套染色體組的遺傳四倍體(4n=100)且是同源四倍體，雌雄泥鰍均能產生正常的2n配子，所以無須卵子加倍處理，操作方法簡單、快捷，避免了繁瑣的人工處理操作程序及理化誘導手段可能對受精卵造成的傷害，提高了孵化率等，是實現魚類雌核發育一條切實可行的途徑，具有巨大的應用價值。附圖說明圖1是本專利技術實施例所制備的雌核發育二倍體泥鰍染色體(2n=50)的圖片。圖2是對照組(2n早X 4n ￠)泥鰍染色體(3n=75)的圖片。具體實施例方式依次按如下步驟進行 a.精、卵的獲得 選取發育良好的雌性天然四倍體(4n=100)及雄性二倍體(2n=50)泥鰍進行催產，水溫24±1°C，效應時間1(T12小時后，確認雌性天然四倍體排卵后，輕壓腹部采卵；同樣輕壓雄性二倍體泥鰍腹部用毛細管采精，所得精液用Kurokura’s solution溶液稀釋100倍待用；精子保存液Kurokura’s solution溶液的配制方法是NaCl 750 mg, CaCl2 20 mg, NaHCO320 mg, KCl 20 mg溶于100 ml蒸懼水中； b.精子的遺傳失活 將二倍體泥鰍精液均勻鋪設于直徑為6cm且涂有厚度為Imm的1%BSA潔凈培養皿內，用紫外線照射二倍體泥鰍的精液，照射劑量為50erg/mm2/SX120S ； c.人工授精 取a步驟所得天然四倍體泥鰍產生的成熟卵子(二倍體)與經b步驟紫外線照射的二倍體泥鰍的精子授精，授精在避光條件下進行，并在避光狀態中孵化15min ； d.受精卵孵化及培育 將所得受精卵收集在裝有淡水的培養皿中孵化，水溫23 土 1°C，挑出未受精的卵或死卵，每天換水兩次，每次換水1/3，待孵化后移入另一容積較大的培育器皿培育，生產出泥鰍雌核發育二倍體魚苗。對本專利技術實施例所得泥鰍倍性檢測 通過早期混合胚胎制片法對本專利技術實施例及對照組的泥鰍體細胞染色體數目進行檢測，對照組與本專利技術實施例的區別是受精卵未經 紫外線照射，即精子的遺傳未失活。早期混合胚胎制片法為取本專利技術實施例及對照組發育眼胞期的胚胎3(T50個，用鑷子剖去卵膜和卵黃后放入盛有0. 0025%的秋水仙素中處理45min，0. 8%的檸檬酸低滲20min，再用預冷的卡諾固定液(甲醇冰醋酸=3 :1)固定3次，每次15 20min，最后-20°C冷凍過夜。冷滴片，10%吉姆薩染色，鏡檢，拍照。本專利技術實施例照片如圖1所示結果表明雄核發育泥鰍染色體為二倍體(2n=50)。對照組照片如圖2所示結果表`明染色體為三倍體(3n=75)。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種誘導天然四倍體泥鰍雌核發育的方法，其特征在于依次按如下步驟進行：a.?精、卵的獲得取天然雌性四倍體泥鰍及雄性二倍體泥鰍進行催產，分別取雌性四倍體泥鰍的卵子及雄性二倍體泥鰍的精液，所得精液用Kurokura’s?solution溶液稀釋100倍待用；b.?精子的遺傳失活將二倍體泥鰍精液均勻鋪設于底面涂有厚度為1mm的1%BSA潔凈培養皿內，用紫外線照射二倍體泥鰍的精液，照射劑量為50erg/mm2/s×120s；c.?人工授精取a步驟所得卵子與經b步驟紫外線照射的二倍體泥鰍的精子授精，授精在避光條件下進行，并在避光狀態中孵化15min；d.?受精卵孵化及培育將所得受精卵收集在裝有淡水的培養皿中孵化，水溫23±1℃，每天換水兩次，每次換水1/3，待孵化后移入另一培育器皿培育，生產出泥鰍雌核發育二倍體魚苗。

【技術特征摘要】
1.一種誘導天然四倍體泥鰍雌核發育的方法，其特征在于依次按如下步驟進行a.精、卵的獲得取天然雌性四倍體泥鰍及雄性二倍體泥鰍進行催產，分別取雌性四倍體泥鰍的卵子及雄性二倍體泥鰍的精液，所得精液用Kurokura’ s solution溶液稀釋100倍待用；b.精子的遺傳失活將二倍體泥鰍精液均勻鋪設于底面涂有厚度為Imm的1%BSA潔凈培養皿內，用紫外線照射二...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李雅娟，王偉，高養春，劉博，王玉生，
申請(專利權)人：大連海洋大學，李雅娟，
類型：發明
國別省市：