穩定表達6個HMW-GS的普通小麥培育方法技術

本發明專利技術涉及一種穩定表達6個HMW-GS的普通小麥培育方法，屬于植物染色體工程技術領域。該方法是以普通小麥為母本，野生二粒小麥為父本，將擁有4個HMW-GS的野生二粒小麥的花粉，授予六倍體的普通小麥，通過種間遠緣雜交、多代自交及鑒定，選育出穩定表達6個HMW-GS的普通小麥。通過本發明專利技術方法培育獲得的具有6個HMW-GS的新型普通小麥，不僅具有與母本相似的株葉型，而且還具有母本所沒有的紫色莖稈性狀，及較母本更優的籽粒粒積性狀、產量性狀和優異的品質特性，且通過連續對雜交種F10、F11和F12代的籽粒進行HMW-GS檢測，證明了其擁有的1Ay基因能夠代代穩定傳遞與表達。

【技術實現步驟摘要】
穩定表達6個HMW-GS的普通小麥培育方法
本專利技術屬于植物染色體工程
，特別涉及一種將四倍體野生二粒小麥的功能性Ay型高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)編碼基因引入普通小麥，實現全部6個HMW-GS均穩定表達的普通小麥的培育方法。
技術介紹
小麥作為世界主要的大宗糧食作物，貢獻了全球總谷物產量的30%左右而成為人類營養素來源的主要作物之一。據估計，到2020年，全球對小麥的需求量將增加40%左右， 因而小麥對人類健康與生存具有舉足輕重的作用。大量研究表明，小麥的營養品質和面粉的加工品質都與種子蛋白的含量和組成密切相關。小麥高分子量谷蛋白亞基(High molecular weight glutenin subunits,HMW-GS) 是小麥的主要貯藏蛋白之一，占小麥蛋白質的10%左右，與小麥面粉的彈性關系密切。業已證明，具有優質高分子量谷蛋白亞基或優質亞基組合的小麥品種具有優良的烘焙品質特性。研究表明，優質面粉所具有的高強度面筋主要在于其所含有的高交聯度大聚合體，而麥谷蛋白的半胱氨酸殘基是形成高交聯度聚合體的決定因子，因而半胱氨酸殘基的數量和 /或位置是影響面粉加工品質的直接因素。在普通小麥aestivum, 2n = 6x = 42，染色體組型為AABBDD)基因組中，編碼HMW谷蛋白的基因Glu-Al, Glu-BlM Glu-Dl分別位于1A，IB和ID染色體的長臂上，每一個高分子量麥谷蛋白基因位點內存在兩個緊密連鎖的基因，分別編碼一個分子量較大的X型亞基，和一個分子量較小的I型亞基，所以，理論上普通小麥應含有6個HMW-GS亞基。但是，由于存在基因的沉默現象，其中，2辦和7尤r常不表達，而腳則總是沉默的，致使Glu-Al位點常常沒有HMW-GS而成為Null位點，因此， 普通小麥通常只擁有3-5個高分子量谷蛋白亞基。現已證明，Glu-Al位點有一個亞基表達的比Null位點具有更高的面筋強度。因此，許多具有高產特性的小麥品種缺乏優良的烘焙品質性能。國內外研究者試圖從小麥近緣屬物種中尋找活性2^7基因，以改良普通小麥的加工品質特性。截至目前，已發現在小麥的近緣植物苑科夫斯基小麥(K zhukovskyi, 2n=6x=42, AAAAGG)、提莫非維小麥{T. timopheevii, 2n=4x=28, AAGG)、野生二粒小麥 (71. dicoccoides, 2n=4x=28, AABB)和二倍體一粒系的(2n=2x=14, AA)烏拉爾圖小麥(71. urartu)，野生一粒小麥(71. Aoeoiicw )和栽培一粒小麥(71.中存在IAy亞基的表達，而且已獲得了 12個活性基因的分子克隆。雖然Margeotta et al. (1996) 報道在兩個瑞典春小麥品系W 29323和W 3879中檢測到表達的IAy亞基，但其活性基因 21*y的擴增片段短于Cheyemme品種中的無活性態等位基因，而且，其表達的Ay基因的來源也不清楚，僅僅是一種推測，認為很可能是某一種野生小麥被用在了育種過程中所引起的。之后，Rogers et al. (1997)報道將二倍體的野生一粒沙達小麥(71· boeoticum ssp. thaoudar)的Glu-ΑΙ位點的IAx和腳基因,通過回交選育近等基因系的方法導入六倍體春小麥面包加工品種Sicco 中。其方法是將居群為CL1020006和G3152的野生一粒沙達小麥{T. b. thaoudar)分別與硬粒小麥(T1. durum, 2n=4x=28, AABB)品種 Cando 和中國春小麥雜交后再與Sicco回交5次，結果在對面筋強度或/和面筋粘性及和面的穩定性上稍微有所提高的同時，對籽粒蛋白質含量和籽粒產量均沒有正效應。僅有的這兩例報道所涉及的普通小麥都屬于春小麥，而且缺乏其相應基因在普通小麥遺傳背景下的分子結構特點分析。2008年，我國的馬建華等用轉基因工程方法將烏拉爾圖小麥(7 rarte)的基因轉入普通小麥蘭考4號，但是，僅僅在Ttl代的I粒種子中檢測到IAy亞基，而且未見其穩定表達的報道。對于野生二粒小麥(7 dicoccoides^ Glu-Al位點y-型亞基編碼基因的利用，目前僅見Ciaffi et al. (1991)將其Ay亞基轉入到四倍體的硬粒小麥(7有效地提高了硬粒小麥面筋強度的報道。野生二粒小麥(AABB)是上聯原始的二倍體一粒系小麥(AA)，下聯進化的六倍體普通小麥(AABBDD)最原始的四倍體橋梁植物，比二倍體小麥更易與六倍體普通小麥有性雜交實現遺傳重組。然而，迄今未見有關野生二粒小麥Glu-Al 位點y型亞基編碼基因向栽培面積更廣闊，生產量和消費量更大的六倍體普通小麥引入的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于為提高小麥高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)，提供一種通過野生二粒小麥與普通小麥遠緣雜交的染色體工程技術，獲得全部6個HMW-GS均穩定表達的普通小麥培育方法。該方法能有效增加普通小麥基因組中的功能性腳基因，實現在普通小麥基因組中，Glu-Al、Glu-Bl、Glu-Dl位點的3個x型和3個y型全部6個HMW-GS基因的表達，從而培育出具有6個高分子量谷蛋白亞基新組合的新型普通小麥。本專利技術的目的是通過以下技術方案來實現的。—種穩定表達6個HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于以普通小麥為母本, 野生二粒小麥為父本，將擁有4個HMW-GS的野生二粒小麥的花粉，授予六倍體的普通小麥， 通過種間遠緣雜交、多代自交及鑒定，選育出穩定表達6個HMW-GS的普通小麥。所述母本選自高產但加工品質差的普通小麥，染色體組型為AABBDD。如小麥推廣品種川農16，為春性冬小麥，其蛋白含量較低，僅有12. 3%，只具有4個高分子量谷蛋白亞基，其IAy亞基編碼基因處于沉默態，具有序列表中SEQ ID NO. 1_3所述的堿基、核苷酸及氨基酸序列。所述父本選自Glu-Al和Glu-Bl位點均表達的含有4個高分子量谷蛋白亞基的野生二粒小麥，染色體組型為AABB，其活性態的IAy亞基基因具有序列表中SEQ ID N0.4-5所述的堿基、核苷酸及氨基酸序列。所述雜交雙親的種植，是秋冬季按株距10cm，行距30cm，行長2m進行雙行田間播種。所述雙親的雜交，是抽穗后對母本穗進行人工去雄，套上硫酸紙袋以防飛花，授以野生二粒小麥花粉后繼續套袋直至成熟。所述多代自交及鑒定包括如下方法步驟A、將經雜交產生的種子進行 SDS-PAGE分析，并對其根尖體細胞染色體數目進行檢測， 選擇具有雙親HMW-GS條帶的、染色體數目為35條的雜種F1代植株。B、將經步驟A選取出的匕代植株在抽穗后套上硫酸紙袋自交，收取F2代種子，按步驟A所述方法進行SDS-PAGE分析和染色體數目檢測，選取35 < 2n < 42和HMW-GS為 6條的籽粒繼續種植套袋自交得F3代，再按步驟A所述方法對F3代籽粒進行檢測和選取。C、對步驟B獲選的F3代種子進行發芽移栽，并自交，連續自交6代后獲得F8代，且每代均選取株葉型、抽穗期、開花期、成熟期趨向母本普通小麥的單株。D、隨機抽取F8代單株，再從各單株收獲籽粒中隨機選取8粒，按步驟A所述的 SDS-P本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種穩定表達6個HMW?GS的普通小麥培育方法，其特征在于：以普通小麥為母本，野生二粒小麥為父本，將擁有4個HMW?GS的野生二粒小麥的花粉，授予六倍體的普通小麥，通過種間遠緣雜交、多代自交及鑒定，選育出穩定表達6個HMW?GS的普通小麥。

【技術特征摘要】
1.一種穩定表達6個HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于以普通小麥為母本， 野生二粒小麥為父本，將擁有4個HMW-GS的野生二粒小麥的花粉，授予六倍體的普通小麥， 通過種間遠緣雜交、多代自交及鑒定，選育出穩定表達6個HMW-GS的普通小麥。2.根據權利要求1所述的穩定表達6個HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于所述母本選自高產但加工品質差的普通小麥，染色體組型為AABBDD，具有4個高分子量谷蛋白亞基，其IAy亞基編碼基因處于沉默態，具有序列表中SEQ ID NO. 1_3所述的堿基、核苷酸及氨基酸序列。3.根據權利要求1所述的穩定表達6個HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于所述父本選自Glu-Al和Glu-Bl位點均表達的含有4個高分子量谷蛋白亞基的野生二粒小麥，染色體組型為AABB，其活性態的IAy亞基基因具有序列表中SEQ ID NO. 4-5所述的堿基、核苷酸及氨基酸序列。4.根據權利要求1所述的穩定表達6個HMW-GS的普通小麥培育方法,其特征在于所述雙親的雜交，是抽穗后對母本穗進行人工去雄，套上硫酸紙袋以防飛花，授以野生二粒小麥花粉后繼續套袋直至成熟。5.根據權利要求1所述的穩定表達6個HMW-GS的普通小麥培育方法，其特征在于所述多代自交及鑒定包括如下方法步驟A、將經雜交產生的種子進行SDS-PAGE分析，并對其根尖體細胞染色體數目進行檢測， 選擇具有雙親HMW-GS條帶的、染色體數目為35條的雜種F1代植株；B、將經步驟A選取出的F1代植株在抽穗后套上硫酸紙袋自交，收取F2代種子，按步驟 A所述方法進行SDS-PAGE分析和染色體數目檢測，選取35 < 2n < 42和HMW-GS為6條的籽粒繼續種植套袋自交得F3代，再按步驟A所述方法對F3代籽粒進行檢測和選取；C、對步驟B獲選的F3代種子進行發芽移栽，并自交，連續自交6代后獲得F8代，且每代均選取株葉型、抽穗期、開花期、成熟期趨向母本普通小麥的單株；D、隨機抽取F8R單株，再從各單株收獲籽粒中隨機選取8粒，按步驟A所述的 SDS-PAGE方法進行HMW-GS檢測；選取具有6個HMW-GS的籽粒進行...

【專利技術屬性】
技術研發人員：伍碧華，王真真，胡喜貴，胡繼良，郭孝輝，王棟，鄭有良，劉登才，蒲至恩，陳國躍，代壽芬，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：