在絲狀真菌中產生C4二羧酸制造技術

本發明專利技術涉及產生C4二羧酸如蘋果酸的方法，其包括：(a)培養包含編碼C4二羧酸轉運蛋白的多核苷酸的宿主細胞；和(b)回收所述C4二羧酸。本發明專利技術亦涉及增加C4二羧酸產生的方法，以及包含所述多核苷酸的宿主細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于在絲狀真菌中改善C4 二羧酸(例如蘋果酸)的產生的方法。
技術介紹
有機酸在多種工業中具有悠久歷史的商業使用。舉例而言，有機酸用于食品和飼料工業(檸檬酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸和葡糖酸)，作為用于產生多種聚合物的單體(己二酸、乳酸、丙烯酸和衣康酸)，作為金屬螯合劑(葡糖酸)和作為“綠色”溶劑(乙酸)(Sauer 等，2008，Trends in Biotechnology26:100-108)。有機酸自身可為商業產品或其可為用于制造其他化學品的化學構件(building block)。除了專門應用之外,長久以來公認C4 二羧酸亦可充當構件化合物以供產生大體積的工業化學品，如1，4-丁二醇，四氫呋喃和Y-丁內酯。由于石油衍生構件的高成本，通過傳統石油化學途徑產生這些大體積工業化學品的成本顯著增加。有機酸在商業上是通過從石油衍生原料的化學合成(例如，延胡索酸、蘋果酸、丙烯酸和己二酸)或通過微生物發酵(例如檸檬酸、乳酸、葡糖酸和衣康酸)產生的。一些有機酸如延胡索酸和蘋果酸亦可通過微生物發酵來產生，但由于更低的生產成本，目前在商業上仍通過化學合成從石油化學原料產生。然而，石油衍生構件化學品的成本的日益升高， 地緣政治的不穩定性對原油價格的影響，以及對實施利用來源于可再生資源的原料的制造工藝的期望，刺激了通過微生物發酵產生有機酸和其他化學品中的重建的興趣。 雖然現在通過化學合成從石油化學原料商業性產生蘋果酸，其亦可通過微生物發酵產生。蘋果酸已在基因工程改造的酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia)) (Zelle 等,2008, Appl. Environ. Microbiol. 74:2766-2777)和天然存在的絲狀真菌如曲霉屬菌種(Aspergillus spp.)(美國專利號 3, 063, 910;Bercovitz 等,1990, Appl. Environ. Microbiol. 56:1594-1597)中以高水平產生。Abe 等(美國專利號 3，063，910)和 Bercovitz 等(1990, Appl. Environ. Microbiol. 56:1594-1597)報道了在幾種曲霉屬菌種中高水平的蘋果酸產生。而且，Battat 等(1991, Biotechnol. Bioengineering, 37:1108-1116)報道了在優化條件下在攪拌的發酵罐中由黃曲霉(Aspergillus flavus)產生了高至113g/ L的蘋果酸。在W02010/003728中描述了在酵母中通過微生物發酵產生二羧酸。亦在 W02009/011974和W02009/155382中描述了通過微生物發酵產生蘋果酸。通過對曲霉屬 (Aspergillus)進行遺傳工程改造改善蘋果酸產生會使得能夠通過發酵經濟地商業性生產蘋果酸。在曲霉屬菌種(Aspergillus spp.)中的蘋果酸過量產生在特定的培養條件(有氧條件和高C:N比；碳酸鈣亦作為中和劑和作為用于蘋果酸生物合成的CO2源添加)下發生。在這些條件下，通過胞質溶膠的、還原性三羧酸(TCA)循環的溢出代謝(overflow metabolism)導致增加的蘋果酸生物合成和分泌入培養基。已在釀酒酵母中報道了通過使用遺傳工程增加丙酮酸羧化酶(Bauer等，1999，FEMSMicrobiol Lett. 179:107-113) 或蘋果酸脫氫酶(Pines 等,1997, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:248-255)的水平和增加蘋果酸轉運蛋白的表達(Zelle等，2008，見上)增加蘋果酸產生。基于生物化學證據，提出了在黃曲霉菌株ATCC13697中，蘋果酸脫氫酶活性限制蘋果酸產生(Peleg 等，1988，Appl. Microbiol. Biotechnol. 28:69-75)。2010 年 4 月 23 日提交，標題為 “Methods for Improving Malic Acid Production in Filamentous Fungi” 的美國臨時申請號61/327，224(其內容通過提述以其整體并入本文)描述了在絲狀真菌中的蘋果酸產生。在本領域中，在曲霉屬中作為使用重組DNA技術的遺傳工程改造的結果而改善C4 二羧酸產生如蘋果酸產生會是有益的。本專利技術提供了用于改善C4 二羧酸產生(例如蘋果酸產生)的方法等。
技術實現思路
本專利技術涉及產生C4 二羧酸(例如蘋果酸)的方法。在一個方面，該方法包括(a) 培養宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞)，所述宿主細胞包含編碼本文中所述的C4 二羧酸轉運蛋白的異源多核苷酸；和(b)回收所述C4 二羧酸(例如蘋果酸)。在另一個方面，該方法包括(a)將編碼本文中所述的C4 二羧酸轉運蛋白的異源多核苷酸轉化入宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞)；(b)在培養基中培養經轉化的生物；和(c)回收所述C4 二羧酸(例如蘋果酸)。本專利技術還涉及宿主細胞(例如絲狀真菌宿主細胞，如米曲霉 (AspergiIIusoryzae)),所述宿主細胞包含本文中所述的多核苷酸,其中所述宿主細胞分泌和/或能夠分泌增加水平的C4 二羧酸(例如蘋果酸)。附圖說明 圖1顯示p41620ssjMAT275的限制圖譜。圖2顯示pShTh60的限制圖譜。圖3顯示pSaMF37的限制圖譜。圖4顯不日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus) C4 二羧酸轉運蛋白基因的基因組密碼子優化的DNA序列(CO)，推導的氨基酸序列，和基因組野生型DNA序列 (WT)(分別為 SEQ ID NO: 1、2 和 3)。定義C4 二羧酸轉運蛋白術語“C4 二羧酸轉運蛋白”在本文中定義為可將蘋果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和/或延胡索酸轉運至細胞外的二羧酸通透酶(Grobler 等，1995，Yeast11:1485-1491;Camarasa 等,2001,Applied and Environmental Microbiology67:4144-4151)。用于預測線粒體輸入的蛋白及其祀向序列的計算方法由 Claros 和 Vincens, 1996，Eur. J. Biochem. 241:779-786 描述。所述C4 二羧酸轉運蛋白具有SEQ ID NO: 2的成熟多肽的C4 二羧酸轉運蛋白活性(例如蘋果酸轉運蛋白活性)的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%,至少 80%,至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少 97%,至少98%,至少99%,或至少100%ο蘋果酸脫氫酶術語“蘋果酸脫氫酶”在本文中定義為在NADH+H+的存在下催化將草酰乙酸還原為蘋果酸和NAD+的蘋果酸NAD+氧還酶(EC1.1.1. 37)。就本專利技術而言，根據下述步驟確定蘋果酸脫氫酶活性。測定溶液由ImM草酰乙酸，IOOmM Tris pH8. 0,10mM NaHCO3, 5mM MgCl2,和 O.1mMNADH(Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.06.04 US 61/351,4251.一種宿主細胞，其包含編碼C4 二羧酸轉運蛋白的異源多核苷酸，其中所述轉運蛋白選自(a)C4二羧酸轉運蛋白，其與SEQ ID NO: 2的成熟多肽具有至少80%序列同一性；(b)C4 二羧酸轉運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等嚴格條件下與以下雜交SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列；(c)C4二羧酸轉運蛋白，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的成熟多肽編碼序列具有至少65%序列同一性；(d)C4二羧酸轉運蛋白變體，其包含SEQ ID N0:2的成熟多肽的一個或多個(例如兩個、幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入；和(e)(a)，(b)，(c)或(d)的C4 二羧酸轉運蛋白的具有C4 二羧酸轉運蛋白活性的片段；其中所述宿主細胞與不具有所述編碼C4 二羧酸轉運蛋白的異源多核苷酸的宿主細胞當在相同條件下培養時相比分泌增加水平的C4 二羧酸。2.權利要求1的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉運蛋白與SEQID N0:2的成熟多肽具有至少90%序列同一性。3.權利要求1的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉運蛋白與SEQID N0:2的成熟多肽具有至少95%序列同一性。4.權利要求1-3任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴格條件下與以下雜交SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。5.權利要求1-3任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉運蛋白由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴格條件下與以下雜交SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3，或其全長互補鏈的成熟多肽編碼序列。6.權利要求1-5任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉運蛋白包含SEQ ID NO: 2的成熟多肽或由SEQ ID NO:2的成熟多肽組成。7.權利要求1-6任一項的宿主細胞，其中SEQID NO: 2的成熟多肽是氨基酸58至450 多肽或SEQ ID NO:2的氨基酸90至450。8.權利要求1-5任一項的宿主細胞，其中所述C4二羧酸轉運蛋白包含SEQ ID NO: 2或由 SEQ ID NO:2 組成。9.權利要求1-8任一項的宿主細胞，其中所述編碼C4二羧酸轉運蛋白的異源多核苷酸可操作地連接于對所述多核苷酸外源的啟動子。10.權利要求1-9任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包含編碼蘋果酸脫氫酶的異源第二多核苷酸。11.權利要求10的宿主細胞，其中所述編碼蘋果酸脫...

【專利技術屬性】
技術研發人員：S麥克法蘭，A費希爾，
申請(專利權)人：諾維信股份有限公司，
類型：
國別省市：