The present invention relates to a method for constructing filamentous fungal strains for producing various recombinant polypeptides with biological activity. The invention also relates to a method for producing a variety of recombinant polypeptides with biological activity in filamentous fungi strains. The invention also relates to filamentous fungal strains expressing various recombinant polypeptides with biological activity.
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
在絲狀真菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多種重組多肽的方法本申請(qǐng)是2014年4月24日提交到中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局的專利技術(shù)名稱為“在絲狀真菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多種重組多肽的方法”、申請(qǐng)?zhí)枮椤?01280052277.8”的專利技術(shù)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。序列表的引用本申請(qǐng)含有計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，其通過(guò)引用的方式合并入本文。專利
本專利技術(shù)涉及在絲狀真菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多種重組多肽的方法。
技術(shù)介紹
在絲狀真菌宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生多肽可以為生產(chǎn)商業(yè)相關(guān)量的多肽提供更為合意的載體。多肽的重組產(chǎn)生通常通過(guò)構(gòu)建表達(dá)盒來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中在表達(dá)盒中，將編碼多肽的DNA置于來(lái)自調(diào)控基因的啟動(dòng)子的表達(dá)控制下。通常通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將表達(dá)盒導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。然后通過(guò)在表達(dá)盒中含有的啟動(dòng)子適當(dāng)發(fā)揮作用所必需的誘導(dǎo)性條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)多肽的生產(chǎn)。可以通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁的再生的方法以本身已知的方式用載體轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞。用兩種或更多種載體單獨(dú)或一起(共轉(zhuǎn)化)轉(zhuǎn)化絲狀真菌宿主細(xì)胞的效率是非常低的，并受到可用的可選擇性標(biāo)記物的可得性的限制。本領(lǐng)域需要一些方法，通過(guò)將串聯(lián)表達(dá)構(gòu)建體定向至一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè))特定基因組基因座來(lái)構(gòu)建能夠表達(dá)多種重組多肽的絲狀真菌菌株，從而實(shí)現(xiàn)所需表達(dá)量的所有目標(biāo)多肽。本專利技術(shù)提供在絲狀真菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多種重組多肽的改進(jìn)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)涉及構(gòu)建用于產(chǎn)生具有生物活性的多種重組多肽的絲狀真菌菌株的方法，包括：(a)通過(guò)向絲狀真菌菌株中導(dǎo)入第一串聯(lián)構(gòu)建體，通過(guò)靶向整合(targetedintegration)來(lái)取代內(nèi)源性第一基因...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種構(gòu)建用于產(chǎn)生具有生物活性的多種重組多肽的絲狀真菌菌株的方法，其包括：(a)通過(guò)向絲狀真菌菌株中導(dǎo)入第一串聯(lián)構(gòu)建體，通過(guò)靶向整合取代內(nèi)源性第一基因，所述第一串聯(lián)構(gòu)建體包含(i)所述第一基因的同源5’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合，(ii)一個(gè)或多個(gè)第一可選擇性標(biāo)記物，(iii)與第一啟動(dòng)子和第一終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)與第二啟動(dòng)子和第二終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合；(b)通過(guò)向所述絲狀真菌菌株中導(dǎo)入第二串聯(lián)構(gòu)建體，通過(guò)靶向整合取代內(nèi)源性第二基因，所述第二串聯(lián)構(gòu)建體包含(i)所述第二基因的同源5’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合，(ii)一個(gè)或多個(gè)第二可選擇性標(biāo)記物，(iii)與第三啟動(dòng)子和第三終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)與第四啟動(dòng)子和第四終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(v)所述第二基因的同源3’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合；或(c)(a)和(b)的組合。
【技術(shù)特征摘要】
2011.08.24 US 61/526,8091.一種構(gòu)建用于產(chǎn)生具有生物活性的多種重組多肽的絲狀真菌菌株的方法，其包括：(a)通過(guò)向絲狀真菌菌株中導(dǎo)入第一串聯(lián)構(gòu)建體，通過(guò)靶向整合取代內(nèi)源性第一基因，所述第一串聯(lián)構(gòu)建體包含(i)所述第一基因的同源5’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合，(ii)一個(gè)或多個(gè)第一可選擇性標(biāo)記物，(iii)與第一啟動(dòng)子和第一終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)與第二啟動(dòng)子和第二終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合；(b)通過(guò)向所述絲狀真菌菌株中導(dǎo)入第二串聯(lián)構(gòu)建體，通過(guò)靶向整合取代內(nèi)源性第二基因，所述第二串聯(lián)構(gòu)建體包含(i)所述第二基因的同源5’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合，(ii)一個(gè)或多個(gè)第二可選擇性標(biāo)記物，(iii)與第三啟動(dòng)子和第三終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)與第四啟動(dòng)子和第四終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(v)所述第二基因的同源3’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合；或(c)(a)和(b)的組合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶I的纖維二糖水解酶I基因：(i)包含SEQIDNO:2的成熟多肽的纖維二糖水解酶I，(ii)包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶I，(iii)由包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I，和(iv)由在至少高等嚴(yán)格條件例如非常高等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I；并且其中所述第二基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶II的纖維二糖水解酶II基因：(i)包含SEQIDNO:4的成熟多肽的纖維二糖水解酶II，(ii)包含與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶II，(iii)由包含與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶II，和(iv)由在至少高等嚴(yán)格條件例如非常高等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶II。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)構(gòu)建體還包含一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物的5’側(cè)翼的第一同源重復(fù)和所述一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物的3’側(cè)翼的第二同源重復(fù)，其中所述第一同源重復(fù)和所述第二同源重復(fù)進(jìn)行同源重組，以切除所述一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物。4.一種絲狀真菌菌株，其包含：(a)通過(guò)靶向整合用第一串聯(lián)構(gòu)建體取代的內(nèi)源性第一基因，所述第一串聯(lián)構(gòu)建體包含(i)所述第一基因的同源5’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合，(ii)一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物，(iii)與第一啟動(dòng)子和第一終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)與第二啟動(dòng)子和第二終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合；(b)通過(guò)靶向整合用第二串聯(lián)構(gòu)建體取代的內(nèi)源性第二基因，所述第二串聯(lián)構(gòu)建體包含(i)所述第二基因的同源5’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合，(ii)一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物，(iii)與第三啟動(dòng)子和第三終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)與第四啟動(dòng)子和第四終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(v)所述第二基因的同源3’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合；或(c)(a)和(b)的組合。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的絲狀真菌菌株，其中所述第一基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶I的纖維二糖水解酶I基因：(i)包含SEQIDNO:2的成熟多肽的纖維二糖水解酶I，(ii)包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶I，(iii)由包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I，和(iv)由在至少高等嚴(yán)格條件例如非常高等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I；并且其中所述第二基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶II的纖維二糖水解酶II基因：(i)包含SEQIDNO:4的成熟多肽的纖維二糖水解酶II，(ii)包含與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶II，(iii)由包含與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶II，和(iv)由在至少高等嚴(yán)格條件例如非常高等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶II。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的絲狀真菌菌株，其中一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)構(gòu)建體還包含所述一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物的5’側(cè)翼的第一同源重復(fù)和所述一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物的3’側(cè)翼的第二同源重復(fù)，其中所述第一同源重復(fù)和所述第二同源重復(fù)進(jìn)行同源重組，以切除所述一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物。7.一種在絲狀真菌菌株中產(chǎn)生具有生物活性的多種重組多肽的方法，其包括：在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)絲狀真菌宿主細(xì)胞，其中所述絲狀真菌宿主細(xì)胞包含：(a)通過(guò)靶向整合用第一串聯(lián)構(gòu)建體取代的內(nèi)源性第一基因，所述第一串聯(lián)構(gòu)建體包含(i)所述第一基因的同源5’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合，(ii)一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物，(iii)與第一啟動(dòng)子和第一終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸，(iv)與第二啟動(dòng)子和第二終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸，和(v)所述第一基因的同源3’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合；(b)通過(guò)靶向整合用第二串聯(lián)構(gòu)建體取代的內(nèi)源性第二基因，所述第二串聯(lián)構(gòu)建體包含(i)所述第二基因的同源5’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合，(ii)一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物，(iii)與第三啟動(dòng)子和第三終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第三多肽的第三多核苷酸，(iv)與第四啟動(dòng)子和第四終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第四多肽的第四多核苷酸，和(v)所述第二基因的同源3’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合；或(c)(a)和(b)的組合。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其還包括回收所述多種重組多肽。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述第一基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶I的纖維二糖水解酶I基因：(i)包含SEQIDNO:2的成熟多肽的纖維二糖水解酶I，(ii)包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶I，(iii)由包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I，和(iv)由在至少高等嚴(yán)格條件例如非常高等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I；并且其中所述第二基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶II的纖維二糖水解酶II基因：(i)包含SEQIDNO:4的成熟多肽的纖維二糖水解酶II，(ii)包含與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶II，(iii)由包含與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶II，和(iv)由在至少高等嚴(yán)格條件例如非常高等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶II。10.根據(jù)權(quán)利要求7～9中任一項(xiàng)所述的方法，其中一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)構(gòu)建體還包含所述一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物的5’側(cè)翼的第一同源重復(fù)和所述一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物的3’側(cè)翼的第二同源重復(fù)，其中所述第一同源重復(fù)和所述第二同源重復(fù)進(jìn)行同源重組，以切除所述一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記物。11.一種串聯(lián)構(gòu)建體，其包含：(i)基因的同源5’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合；(ii)一個(gè)或多個(gè)第一可選擇性標(biāo)記物；(iii)與第一啟動(dòng)子和第一終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第一多肽的第一多核苷酸；(iv)與第二啟動(dòng)子和第二終止子可操作連接的編碼具有生物活性的第二多肽的第二多核苷酸；和(v)所述基因的同源3’區(qū)、其同源側(cè)翼區(qū)或其組合。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的串聯(lián)構(gòu)建體，其中所述基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶I的纖維二糖水解酶I基因：(i)包含SEQIDNO:2的成熟多肽的纖維二糖水解酶I，(ii)包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶I，(iii)由包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I，和(iv)由在至少高等嚴(yán)格條件例如非常高等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶I；或其中所述基因是編碼選自以下的纖維二糖水解酶II的纖維二糖水解酶II基因：(i)包含SEQIDNO:4的成熟多肽的纖維二糖水解酶II，(ii)包含與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的纖維二糖水解酶II，(iii)由包含與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸所編碼的纖維二糖水解酶II，和(iv)由在至少高等嚴(yán)格條件例如非常高等嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)體雜交的多核苷酸所編碼的纖維二...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D·亞韋，金綺明，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：諾維信股份有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：美國(guó),US
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