本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種電化學(xué)生物傳感器制備方法，尤其涉及一種脫氫酶型電化學(xué)生物傳感器的制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)通過將傳感器制備過程中的電極修飾所需要的全部組分(包括碳納米材料、電子介體、高分子聚合物、脫氫酶、輔酶和緩沖液)制備成為一種納米生物復(fù)合材料，并將該復(fù)合材料通過簡單的一步滴涂法修飾到絲網(wǎng)印刷電極表面，制備脫氫酶型電化學(xué)生物傳感器。本方法簡化了脫氫酶型傳感器的制備工藝，適用于批量生產(chǎn)，減小了批內(nèi)、批間差異，提高了檢測的靈敏度、準(zhǔn)確性和存儲穩(wěn)定性。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種電化學(xué)生物傳感器的制備方法，尤其涉及脫氫酶型生物傳感器的制備方法。
技術(shù)介紹
隨著社會發(fā)展的日新月異和人們生活水平的顯著提高，傳統(tǒng)的臨床檢驗(yàn)?zāi)Ｊ剑捎诖嬖跇?biāo)本從采集到檢測前缺乏有效的分析前質(zhì)量控制，標(biāo)本檢測周期較長，對儀器的依賴程度較高等不足，已然不能滿足人們越來越高漲的健康評估需求。隨著科技的突飛猛進(jìn)，POCT (Point of Care Test)產(chǎn)業(yè)煥發(fā)出了新生的活力。由于具有檢測快速、操作簡單易學(xué)、檢測成本低廉的突出優(yōu)點(diǎn)，POCT在臨床檢驗(yàn)效能中所占的比重越來越大。近年來，POCT領(lǐng)域中的一個(gè)重要分支，電化學(xué)生物傳感器，作為一種現(xiàn)場定量檢測標(biāo)本的新技術(shù)，能夠有效地彌補(bǔ)干化學(xué)試紙條和金標(biāo)條只能定性、不能定量的不足，因而受到了國內(nèi)外科技工作者的廣泛關(guān)注。電化學(xué)生物傳感器的基本原理是將生物識別層修飾到工作電極的表面，通過生物識別層與樣本中的底物發(fā)生特異性氧化還原反應(yīng)，從而產(chǎn)生可檢測的電化學(xué)信號，直接或間接反映待測底物的濃度。脫氫酶系統(tǒng)是生物體內(nèi)重要的新陳代謝系統(tǒng)，約有300種脫氫酶參與生命的運(yùn)作。通過脫氫酶與特異的底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，我們可以定量評估該特異的底物在體內(nèi)的分布和代謝情況，進(jìn)而直觀地了解生命健康狀況。反應(yīng)模型以如下方程式表示 底物 +NAD+/NADP+ 廳_ r 產(chǎn)物 +NADH/NADPH + H+比如，基于葡萄糖脫氫酶檢測血糖含量，用于診斷糖尿病及評估治療效果；又如，基于乳酸脫氫酶檢測血乳酸含量，用于評估患者缺氧情況，便于醫(yī)師采取有效地治療措施。在脫氫酶系統(tǒng)中，氧化還原反應(yīng)需要氧化型輔酶NAD+或NADP+的參與，生成還原型輔酶NADH或NADPH。研究發(fā)現(xiàn)，還原型輔酶NADH或NADPH是電活性物質(zhì)，在一定的激發(fā)電壓下，可氧化產(chǎn)生電流，此現(xiàn)象為脫氫酶型電化學(xué)生物傳感器的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。然而，電化學(xué)生物傳感器檢測NADH或NADPH，面臨著一些難點(diǎn)(I)在電極表面直接氧化NADH或NADPH的過電位較高，導(dǎo)致電極容易因吸附反應(yīng)產(chǎn)物而鈍化和受到其他電活性物質(zhì)(比如，抗壞血酸、尿酸、兒茶酚胺、多巴胺以及一些藥物分子)的干擾，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性難以保證；(2)制備的傳感器檢測NADH或NADPH的靈敏度不高，導(dǎo)致傳感器對目標(biāo)物的檢測敏感度不夠，難以識別低濃度的目標(biāo)分子；(3)目前，文獻(xiàn)中報(bào)道的關(guān)于脫氫酶型傳感器的制備方法往往包括多步修飾(Talanta. 2012,99 =697-702 ；Sensors. 2010，10 748-764 Analytical Biochemistry. 2012,425 :36-42)，或者是輔酶未預(yù)先修飾到電極表面(Electroanalysis· 2010, 22 :1707-1716 ;Biosensors and Bioelectronics. 2012,33 100-105)，而是作為試劑與待測標(biāo)本混合后才用于檢測。雖然這些方法能夠一定程度上提高傳感器的性能，但也導(dǎo)致所制備的生物傳感器未能充分體現(xiàn)檢測快速，操作簡單、現(xiàn)場檢測的優(yōu)點(diǎn)。碳納米材料，具有獨(dú)特的電化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)，比如，高效的電催化活性、高比表面積、宏觀量子隧道效應(yīng)和優(yōu)良的生物相容性，在電化學(xué)傳感器領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。碳納米材料作為傳感器的電極修飾材料，能夠明顯地提高傳感器檢測的靈敏度和線性范圍，并且極大地降低還原型輔酶NADH或者NADPH在電極表面氧化的過電位，有效地避免了一些電活性物質(zhì)，比如尿酸、兒茶酚胺、多巴胺的干擾。但是，抗壞血酸的干擾卻未能有效消除，使得傳感器的準(zhǔn)確性和實(shí)用性仍然面臨巨大挑戰(zhàn)(Electroanalysis. 2011,23 :842-849)。研究發(fā)現(xiàn)，一些電子介體，如麥爾多拉藍(lán)、亞甲藍(lán)、亞甲綠等，能特異的與NADH或者NADPH形成復(fù)合物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)低電位檢測NADH或者NADPH，而不受其他電活性物質(zhì)的干擾。然而，這些電子介體為水溶性分子，常規(guī)包埋的方法不能有效地使其固定在電極的表面而不發(fā)生丟失，導(dǎo)致電化學(xué)信號很不穩(wěn)定。文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道通過電聚合的方法能高效地固定電子介體(Talanta. 2000, 51 :187-195 ;Journal of Solid StateElectrochemistry. 2008,12 :175-180),但電聚合的方法增加電子介體消耗，增加傳感器的制備步驟，增大傳感器的批內(nèi)、批間差異。此外，利用碳納米材料或陰離子型聚合物直接吸附電子介體也有文獻(xiàn)報(bào)道。例如，Zhu等將N，N-二甲基甲酰胺分散的羧基化碳納米管修飾到玻碳電極表面，然后將其浸入麥爾多拉藍(lán)溶液中，吸附一段時(shí)間，得到了碳納米管/麥爾多拉藍(lán)修飾電極，該傳感器對還原型輔酶NADH表現(xiàn)出高的靈敏度和寬的線性范圍(Biosensors and Bioelectronics. 2007,22 :2768-2773) ;zheng 等將碳納米管 / 納米金/Nafion-117復(fù)合膜修飾的絲網(wǎng)印刷電極浸入麥爾多拉藍(lán)溶液中一段時(shí)間，得到了碳納米管/納米金/麥爾多拉藍(lán)/Nafion-117復(fù)合膜修飾電極，并用該復(fù)合膜電極成功制備乙醇脫氫酶型傳感器，得到的電極表現(xiàn)出優(yōu)良的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性(ForensicScienceInternational. 2011,207 :177-182)，但這兩種方法同樣表現(xiàn)出電極修飾步驟較多，無法對傳感器進(jìn)行快速批量生產(chǎn)的不足。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種可用于批量生產(chǎn)脫氫酶型電化學(xué)生物傳感器的快速制備方法。本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的(I)將碳納米材料超聲分散于高分子聚合物中，得到均勻分散的碳納米材料懸液后，加入電子介體，混勻后過夜，再加入脫氫酶、輔酶和緩沖液，再次混勻，即得到修飾電極所需的納米生物復(fù)合材料；(2)將制備的納米生物復(fù)合材料滴涂到絲網(wǎng)印刷電極的工作電極表面，4攝氏度避光晾干，即得脫氫酶型電化學(xué)生物傳感器。所述碳納米材料包括單壁碳納米管、多壁碳納米管、有序介孔碳或石墨烯中的一種或幾種。所述電子介體包括麥爾多拉藍(lán)、亞甲藍(lán)、新亞甲藍(lán)或亞甲綠中的一種或幾種。所述高分子聚合物為殼聚糖。所述脫氫酶包括葡萄糖脫氫酶、乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、a-羥丁酸脫氫酶或異檸檬酸脫氫酶中的一種。所述輔酶包括氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)的一種或兩種。所述納米生物復(fù)合材料的pH值為6. O 6. 5。所述緩沖液包括醋酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中的一種或幾種。所述絲網(wǎng)印刷電極為2電極體系或3電極體系中的一種。本專利技術(shù)中，制備納米生物復(fù)合材料所使用的材料均行使著不同的作用和功 能高分子聚合物作為碳納米材料的分散劑和脫氫酶的固定劑；碳納米材料作為信號放大材料和電子介體的固定載體；電子介體作為還原型輔酶NADH的高效識別分子來實(shí)現(xiàn)低電位檢測；緩沖液作為穩(wěn)定劑來穩(wěn)定酶、輔酶和電子介體的活性。本專利技術(shù)通過科學(xué)、合理地制備納米生物復(fù)合材料，用于一步滴涂的方法構(gòu)建脫氫酶型電化學(xué)生物傳感器，從而簡化脫氫酶型生物傳感器的制備工藝，提高存儲穩(wěn)定性和檢測準(zhǔn)確性。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種脫氫酶型電化學(xué)生物傳感器制備方法，其特征在于包括如下步驟：(1)將碳納米材料超聲分散于高分子聚合物中，得到均勻分散的碳納米材料懸液后，加入電子介體，混勻后過夜，再加入脫氫酶、輔酶和緩沖液，再次混勻，即得到修飾電極所需的納米生物復(fù)合材料；(2)將制備的納米生物復(fù)合材料滴涂到絲網(wǎng)印刷電極的工作電極表面，4攝氏度避光晾干，即得脫氫酶型電化學(xué)生物傳感器。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：花爾輝，謝國明，蔣舒婷，趙朝輝，馬翠霞，王力，景小瑩，羅鵬，
申請(專利權(quán))人：重慶醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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