本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種可尋址電化學(xué)傳感器陣列制備，及采用所述的可尋址電化學(xué)傳感器測定樣品中多種腫瘤標志物的方法。通過配制合適的油墨，在適當(dāng)?shù)幕撞牧仙希∷⑿须姌O和列電極；選擇合適的紙材料，利用蠟打印技術(shù)在紙上制備反應(yīng)疏水區(qū)域和親水區(qū)域，在另一層紙基材料上通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)構(gòu)建陣列電極共用的參比電極和對電極；對制備好的親水區(qū)域功能化，抗原識別，信號分子標記；將制備好的工作電極、參比電極及對電極和制備好的反應(yīng)區(qū)域進行組裝，構(gòu)建可尋址電化學(xué)傳感器陣列；在反應(yīng)區(qū)域滴加酶底物，在印有參比電極及對電極的紙層上加入磷酸緩沖溶液，對目標物進行檢測。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及腫瘤標志物檢測
，更具體地說是一種可尋址電化學(xué)傳感器陣列制備，本專利技術(shù)還涉及采用所述的可尋址電化學(xué)傳感器測定樣品中多種腫瘤標志物的方法。
技術(shù)介紹
癌癥是嚴重威脅人類健康的具有高發(fā)病率和高死亡率的疾病之一，然而，若在癌癥發(fā)展的早期階段即能將其診斷出來，將大大提高病人的存活率。可以說，早期診斷和早期治療是預(yù)防癌癥發(fā)展和降低死亡率最有效的辦法之一。腫瘤標志物是在腫瘤發(fā)生和增殖過程中由腫瘤細胞所產(chǎn)生、分泌并釋放到血液、細胞、體液中，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)。它是腫瘤細胞在人體內(nèi)存狀態(tài)的具體表征，可以直接反應(yīng)腫瘤細胞在體內(nèi)的發(fā)展以及患者治療效果等情況。目前已有少量腫瘤標志物被應(yīng)用于臨床檢測。然而，單個腫瘤標志物的檢測往往導(dǎo)致腫瘤檢測的假陽性或假陰性，如果能同時檢測多種腫瘤標志物則可以大大提高腫瘤檢測的靈敏性、特異性和準確性。建立一種高靈敏度和特異性的快速篩檢多種腫瘤標志物的方法，便成為當(dāng)前該研究領(lǐng)域亟需解決的問題之一。目前已有的腫瘤標志物檢測或篩檢方法存在不足臨床上為了避免單一腫瘤標志物在檢測中的陽性率不高、特異性不強等問題，常采用多種腫瘤標志物聯(lián)合檢測，應(yīng)用多變量分析的方法來提高腫瘤診斷的陽性率和特異性。常用的血清腫瘤標志物檢測方法有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析以及化學(xué)發(fā)光免疫測定等，這些方法都有一個共同的局限性，即每次僅能檢測一種腫瘤標志物。對于多種腫瘤標志物檢測一般采用多信號標記模式，該模式需要同時檢測不同標記的信號，因此通常存在一定的困難在準確定量，由于信號交叉及不同標記的最優(yōu)條件差異，同時非常困難找到多種標志物的可利用的標記信號分子。為了克服這些缺點，設(shè)計采用空間分辨模式，不同目標物在不同的反應(yīng)區(qū)域進行檢測。電化學(xué)免疫傳感器是一種將電化學(xué)分析方法與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點的生物傳感器。與傳統(tǒng)的免疫測試相比，免疫生物傳感器集免疫反應(yīng)、信號產(chǎn)生、信號檢測一體化，具有定量檢測和實時檢測傳感器表面的抗原抗體反應(yīng)的功能，有利于對免疫反應(yīng)進行動力學(xué)分析，尤其在臨床腫瘤標志物診斷領(lǐng)域，其作用越來越受到重視，成為目前較活躍的研究領(lǐng)域。采用空間分辨模式，不同目標物在不同的反應(yīng)區(qū)域進行檢測，設(shè)計可尋址電化學(xué)免疫傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)多種腫瘤標志物同時檢測、快速、成本低、微型化、高通量、現(xiàn)場檢測。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提供了一種可尋址電化學(xué)免疫傳感器陣列的制備及能夠?qū)崿F(xiàn)多種腫瘤標志物同時、快速、成本低、微型化、高通量、現(xiàn)場檢測方法。為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)是通過以下措施來實現(xiàn)的一種可尋址電化學(xué)免疫傳感器陣列的制備方法，其特征是包括以下步驟 (1)配制合適的油墨，選擇合適的基底材料，印刷行電極(rowelectrode)和列電極(column electrode)； (2)選擇合適的紙基材料，利用蠟打印技術(shù)在紙上制備反應(yīng)疏水區(qū)域(絕緣區(qū)域)和親水區(qū)域(反應(yīng)區(qū)域)； (3)在另一層紙基材料上通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)構(gòu)建陣列電極共用的參比電極和對電極； (4)對(2)中未水區(qū)域功能化，將包被抗體和硫堇固定在未水區(qū)域； (5)將目標物或者血清樣品在固定包被抗體的反應(yīng)區(qū)域孵育； (6)酶和信號抗體固定于多壁碳納米管制備信號放大分子； (7)將(6)制備好的信號放大分子加入到(5)處理過的區(qū)域孵育一定時間； (8)將(I)制備好的工作電極及(3)制備好的參比電極及對電極和制備好的反應(yīng)區(qū)域進行組裝，構(gòu)建可尋址電化學(xué)傳感器陣列； (9)在反應(yīng)區(qū)域滴加酶底物，在印有參比電極及對電極的紙層上加入磷酸緩沖溶液(PBS )，連接電化學(xué)設(shè)備進行檢測。一種制備上述可尋址電化學(xué)傳感器陣列的方法，及對血液中的腫瘤標志物進行檢測，其特征在于該方法的具體步驟為 (1)采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)、石墨為原料，取等體積的丙酮和環(huán)己酮溶液，再加入對應(yīng)量的乙酸纖維素，使用超聲波超聲使乙酸纖維素充分地溶解在丙酮和環(huán)己酮的混合溶劑中，最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混勻，在聚乙烯對苯二甲酸酯基底上印制直徑5mm的行電極和列電極，正交后行電極與列電極重合，形成4X6電極陣列； (2)用Adobeillustrator CS4設(shè)計圖案，利用蠟打印技術(shù)在紙上打印圖案，將打印蠟的圖案放在恒溫150°C下2min，未打印蠟的地方親水區(qū)作為工作區(qū)； (3)通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)在另一張紙上印刷碳對電極和Ag/AgCl參比電極； (4)將多壁碳納米管(MWCNTs)在3:1H2S04/HN03溶液中、功率300W下超聲5h進行羧基化，在(2)制作的工作區(qū)中加入一定量的羧基化的MWCNTs，滴加一定量的0.25 mg/mL殼聚糖，室溫干燥，滴加2. 5%的戊二醛活化2h，將包被抗體和硫堇固定到工作區(qū)，加入2%牛血清白蛋白封閉活性位點，制備修飾工作區(qū)； (5)將目標抗原或者血清樣品加入到(4)制備的工作區(qū)，孵育一定時間； (6)利用步驟(4)中羧基化的多壁碳納米管，將辣根過氧化物酶和信號抗體按照一定比例在碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)的活化下將辣根過氧化物酶和信號抗體固定于 MWCNTs 上； (7)將(6)制備好的負載信號抗體和辣根過氧化物酶的多壁碳納米管加入到制備好的(5)中，孵育一定時間； (8)將(I)制備好的工作電極及(3)制備好的參比電極及對電極和制備好的反應(yīng)區(qū)域進行構(gòu)建電極陣列，連接相應(yīng)電化學(xué)設(shè)備對腫瘤標志物的進行檢測； (9)在工作區(qū)域加入辣根過氧化物酶底物0.lmol/L H2O2，將對電極和參比電極紙層在0. lmol/L的磷酸緩沖溶液(PBS)中浸濕，檢測電流信號。本專利技術(shù)所述電極基底材料為聚乙烯對苯二甲酸酯、聚氯乙烯、陶瓷或者玻璃。本專利技術(shù)所述紙材料為I級色譜紙、3級色譜紙、4級色譜紙和17級色譜紙。本專利技術(shù)構(gòu)建了一種新型可尋址電化學(xué)傳感器陣列，用于檢測多種腫瘤標志物及癌癥的篩查，取得了滿意的結(jié)果，應(yīng)用前景廣泛。附圖說明圖1 : A. a為行電極，b為Ag/AgCl為反應(yīng)參比電極,c為工作區(qū)，d為列電極；B.可尋址電化學(xué)傳感器陣列檢測體系。圖2 :工作區(qū)的組裝原理圖。具體實施例方式 可尋址電化學(xué)傳感器陣列的制備及用于多種腫瘤標志物的檢測和癌癥的篩查 (1)采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)、石墨為原料，首先取等體積的丙酮和環(huán)己酮溶液混合稱重，再稱取對應(yīng)量的乙酸纖維素加入上述溶液中，使用超聲波超聲使乙酸纖維素充分地溶解在丙酮和環(huán)己酮的混合溶劑中，最后加入一定量的石墨粉,用玻璃棒充分混勻,在聚乙烯對苯二甲酸酯基底上印制直徑5mm的行電極和列電極，正交后行電極與列電極重合，形成4X6電極陣列； (2)用Adobeillustrator CS4設(shè)計圖案,利用臘打印技術(shù)通過打印機在I級色譜紙上打印圖案，將打印蠟的圖案放在恒溫150°C下2min，在設(shè)計的紙上圖案區(qū)作為疏水區(qū)，未打印蠟的地方親水區(qū)作為工作區(qū)，每張紙上印有24工作區(qū)(4X6，直徑5mm)； (3)通過絲網(wǎng)印刷技術(shù)在另一張紙上印刷碳對電極和Ag/AgCl參比電極； (4)將多壁碳納米管(MWCNTs)在3:1H2S04/HN03溶液中、功率300W下超聲5h進行羧基化，在(2)制作的工作區(qū)中加入10 UL的功能本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種可尋址電化學(xué)傳感器陣列的制備及能夠?qū)崿F(xiàn)多種腫瘤標志物同時檢測，其特征是包括以下步驟：1.1配制合適的油墨，在適當(dāng)?shù)牟牧仙希苽湫须姌O和列電極；1.2選擇合適的紙材料，在紙上制備反應(yīng)疏水區(qū)域和親水區(qū)域；1.3構(gòu)建所有反應(yīng)區(qū)域共用的參比電極和對電極；1.4對1.2中親水區(qū)域功能化，將包被抗體和硫堇固定在親水區(qū)域；1.5將目標物和血清樣品在固定包被抗體的反應(yīng)區(qū)域孵育；1.6酶和信號抗體固定于多壁碳納米管制備信號放大分子；1.7將1.6制備的信號放大分子加入到1.5中孵育一定時間；1.8將1.1制備好的工作電極及1.3制備好的參比電極及對電極和制備好的反應(yīng)區(qū)域進行組裝，構(gòu)建可尋址電化學(xué)傳感器陣列；1.9在反應(yīng)區(qū)域滴加酶底物，在印有參比電極及對電極的紙層上加入磷酸緩沖溶液（PBS），檢測電流信號。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：葛慎光，于京華，顏梅，葛磊，黃加棟，張彥，李偉平，李蒙，王衍虎，李龍，蘇敏，
申請(專利權(quán))人：濟南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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