一種農(nóng)藥降解酶劑及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及酶劑制備工藝的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種農(nóng)藥降解酶劑及其制備方法。所述所述農(nóng)藥降解酶劑為保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC?No.1529的基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體破碎的上清液。本發(fā)明專利技術(shù)制備的農(nóng)藥降解酶劑能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，可以去除水果、蔬菜表面農(nóng)藥殘留，保障食品安全。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及酶制劑制備工藝的
，具體地說是。
技術(shù)介紹
農(nóng)藥殘留導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境惡化，威脅食品安全，一直是國內(nèi)外關(guān)注的問題。農(nóng)藥殘留的生物降解是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，利用基因工程手段構(gòu)建農(nóng)藥解毒酶基因工程菌，發(fā)酵并表達(dá)農(nóng)藥降解酶是是目前解決農(nóng)藥殘留問題的有效技術(shù)手段，具有安全、高效、無二次污染等特點(diǎn)。農(nóng)藥降解酶的制備工藝直接關(guān)系到酶活力的高低，利用基因工程菌制備農(nóng)藥降解 酶的工藝包括種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、菌體收集、菌體破碎和粗酶提取等步驟。在種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)過程中要保持一定的抗生素壓力以保持工程菌中的質(zhì)粒不丟失。在發(fā)酵前期要加入誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)酶蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)物一般為異丙基硫代半乳糖苷。酶蛋白通常存在于細(xì)胞內(nèi)部，所以發(fā)酵結(jié)束后首先要收集菌體，離心法簡單易行且回收率高，是工業(yè)化生產(chǎn)首選的收集方法。菌體破碎是粗酶提取的關(guān)鍵工藝，直接關(guān)系到酶活性高低和酶液的品質(zhì)。菌體破碎方法有超聲波破碎、真空負(fù)壓破碎、機(jī)械攪拌破碎、低溫凍融破碎等方法，其中超聲波破碎方法簡單且效率較高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案為一種農(nóng)藥降解酶劑，所述農(nóng)藥降解酶劑為，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCC No. 1529的基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體破碎的上清液。農(nóng)藥降解酶劑為在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的基因工程菌菌液再經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液；即將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)10-15小時(shí)，而后按體積比1% -5%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C，溶氧量20-30%，培養(yǎng)2-4小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到22°C -25°C，誘導(dǎo)表達(dá)18-22個(gè)小時(shí)后菌體經(jīng)過破碎并回溶于原發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液，離心得到的上清液即為降解酶劑。農(nóng)藥降解酶劑的制備方法，將基因工程菌在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中370C，溶氧量20-30 %，培養(yǎng)10-15小時(shí)，而后按體積比I % _5%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，37 °C，溶氧量20-30 %，培養(yǎng)2-4小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到22°C _25°C，誘導(dǎo)表達(dá)18-22個(gè)小時(shí)后菌體經(jīng)過破碎并回溶于原發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液，離心得到的上清液即為降解酶劑。將上述所得發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入發(fā)酵液體積1/10-1/20的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶菌體，而后以5000rpm離心10分鐘收集菌體，將收集的菌體中加入液氮破碎菌體，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體冷凍干燥，將凍干后的菌體用O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，再以10000-12000Rpm離心10-20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。所述發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計(jì)，蛋白胨2% -3 %、酵母粉2% -3 %、甘油2% -3%, K2HPO4 O. 25%, KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。所述LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計(jì)，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉I %，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50-75 μ g的氨芐青霉素。所述回溶菌體離心收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌體，加入液氮的高度高于菌體表面O. 5-lcm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體真空冷凍干燥，其真空度30pa，凍干溫度-50°C，凍干時(shí)間8-12h。所述降解酶劑用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。 本專利技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)為1.本專利技術(shù)制備的農(nóng)藥降解酶劑能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，可以去除水果、蔬菜表面農(nóng)藥殘留，保障食品安全。2.本專利技術(shù)制備的農(nóng)藥降解酶劑酶活力高，作用迅速。3.本專利技術(shù)制備的農(nóng)藥降解酶劑酶活力穩(wěn)定。不易失活。4.本專利技術(shù)制備的農(nóng)藥降解酶劑安全高效，無毒副作用。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號=CGMCCNo. 1529的基因工程菌株接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37°C，溶氧量20%，培養(yǎng)時(shí)間10個(gè)小時(shí)。LB液體培養(yǎng)基為按重量百分比計(jì)，胰蛋白胨I %、酵母粉0.5%、氯化鈉I %，余量為蒸餾水，121°C滅菌20分鐘；含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基為每毫升LB液體培養(yǎng)基中添加50 μ g的氨芐青霉素。所述基因工程菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No. 1529，另參見申請?zhí)?00510086957. 3中的相關(guān)記載。而后按體積比1%的接種量將培養(yǎng)液接種于含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，在370C，溶氧量20%，培養(yǎng)2小時(shí)后向發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為25mmol/L的乳糖后，將培養(yǎng)溫度降到25°C，誘導(dǎo)表達(dá)20個(gè)小時(shí)后將發(fā)酵液以5000rpm離心10分鐘收集菌體，并加入1/10發(fā)酵液體積的O. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液(稱取Na2HPO4 · 2H20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計(jì)加以校正。)回溶菌體，5000rpm離心10分鐘重新收集菌體，將收集的菌體平鋪于鐵制或鋼制容器中，菌體厚度0.1cm,向容器中加入液氮破碎菌體，液氮的高度高于菌體表面0. 5cm，待液氮揮發(fā)干凈后將菌體置于真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，其中真空冷凍干燥真空度30pa，凍干溫度_50°C，凍干時(shí)間12h，將凍干后的菌體用0. lmol/L pH 7. O的磷酸鹽緩沖液回溶至原發(fā)酵液體積，IOOOORpm離心20分鐘收集上清液，即為農(nóng)藥降解酶劑。發(fā)酵培養(yǎng)為按重量百分比計(jì)，蛋白胨2%、酵母粉2%、甘油2%、K2HPO4 O. 25%,KH2PO4 O. 016%, NaCl O. 05%, MgSO4 · H2O O. 025%，蒸餾水，121°C滅菌 20 分鐘；含氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基為每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加50 μ g的氨芐青霉素。檢測上述制備所得農(nóng)藥降解酶的酶活力吸取980 μ I O. lmol/L pH7. O的磷酸鹽緩沖液，10 μ I 10mg/mL的對硫磷溶液(稱取對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL)，充分混勻，加入10 μ I上述農(nóng)藥降解酶劑，30°C反應(yīng)I分鐘，用20 μ I 6mol/L的HCl終止反應(yīng)，吸取O. 5ml加入4. 5mL O. 05mol/L ρΗΙΟ. O的NaOH-甘氨酸緩沖液(甘氨酸3. 78g，氫氧化鈉1. 28g，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。上述緩沖液的pH值應(yīng)使用酸度計(jì)加以校正。)充分混勻，于410nm波長下測定本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種農(nóng)藥降解酶劑，其特征在于：所述農(nóng)藥降解酶劑為，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC?No.1529的基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體破碎的上清液。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：謝建飛，石元亮，盧宗云，張惠文，李鵬程，邢云鵬，李敏，
申請(專利權(quán))人：遼寧中科生物工程有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：