本發明專利技術涉及一種微生物新菌種粘紅酵母CCZU-G5及其在生物催化2-氧代-4苯基丁酸乙酯制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應用，所述的粘紅酵母CCZU-G5保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為6328。所述的方法是以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯為底物，以粘紅酵母CCZU-G5全細胞為生物催化劑，在水/有機溶劑兩相體系中進行微生物不對稱催化還原反應，反應結束后轉化液經過分離純化得到(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。本發明專利技術與傳統方法相比，在保證高產率和高立體選擇性的同時提高底物的摩爾轉化率，整個反應過程不需要添加輔酶，反應條件溫和，操作簡單、產品易于分離、無副產物生成、對設備要求不高、環境友好且生產成本明顯降低，在工業上是一種能提高生產效益的新方法。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及不對稱生物催化
，尤其涉及一種微生物新菌種粘紅酵母 (Rhodotorula mucilaginosa)CCZU-G5,以及該微生物在水/有機溶劑兩相體系中全細胞不對稱催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯合成(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的制備方法。
技術介紹
(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是有機合成中一種重要的手性醫藥中間體，被廣泛用于賴諾普利、苯那普利、西拉普利、依那普利和雷米普利等眾多普利類血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)的合成中。這些普利類藥物通過抑制血管緊張素轉換酶的活性和血管緊張素的生成來產生降壓作用，是目前市場上最暢銷的用于治療高血壓和充血性心力衰竭等心血管疾病的藥物之一。(R) -HPBE的制備方法主要有化學法和生物法，二者又都包括拆分和合成兩種途徑。拆分法是通過物理、化學或生物的手段將外消旋化合物分離成某單一對映體的手性化合物，但該方法需要先合成外消旋的目標底物，然后再進行拆分，理論產率不超過50%。從原子經濟的角度來說，該方法較實用但不夠經濟。化學合成法，主要包括由手性試劑催化的不對稱還原和由手性催化劑催化的不對稱還原兩種。化學合成法原子經濟性較高，但光學選擇性較差，副產物較多，污染較嚴重，且手性試劑和催化劑的價格昂貴，制備也比較困難。生物法中直接利用醇脫氫酶催化底物制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，雖然具有反應條件溫和、立體選擇性高、環境友好等優點，但是整個反應過程中不僅要有酶蛋白參加反應，而且還要添加價格昂貴的輔助因子，在實際應用中受到一定的限制。生物催化是利用酶或微生物細胞作為催化劑進行化學反應的過程，具有高度的專一性、催化效率高、環境友好、操作條件溫和等優點。與水相生物催化反應相比，非水相生物催化有其獨特的優越性，如可大幅度增加水不溶性底物和產物的溶解度；可改變反應的平衡點，使 反應向所期望的方向進行；能提高有機溶劑中酶的熱力學和操作穩定性；可減少水相中副反應的發生；減少反應后產物的分離過程等。對于微生物催化的羰基不對稱還原反應，由于反應需要昂貴的輔酶參與，而微生物細胞含有可以接受廣泛非天然底物的多種脫氫酶、所有必需的輔酶及其再生途徑，輔酶循環再生由細胞自動完成。進行不對稱還原反應時只需加入少量的能源物質如葡萄糖或醇類等作為輔助底物即可，同時所有的酶和輔酶處在天然的細胞環境中，可減少環境因素對酶活的影響。因此，與純酶催化相比，利用微生物全細胞進行不對稱催化反應具有不可比擬的優勢。由于生物催化高度的專一性，利用微生物全細胞催化不對稱還原，可以直接將前手性的底物直接轉化為目標產物，因此全細胞催化成為國內外研究和開發的熱點。同時由于2-羰基-4-苯基丁酸乙酯易于合成且價格低廉，以其為底物進行微生物催化的不對稱還原反應獲得具有光學活性的(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是非常經濟有效的制備途徑，而且反應產物不易為微生物代謝所利用，用微生物活細胞催化制備(R)-2_羥基-4-苯基丁酸乙酯非常有利。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是針對目前(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的合成在成本，立體選擇性，產物產率，對環境的影響方面存在的缺陷，為了解決上述問題，本專利技術提供一種可供生物轉化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯合成(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯微生物新菌種粘紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)CCZU_G5,以及該菌株在不對稱生物催化合成(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的應用，該應用在保證高產率和高光學純度的同時提高底物了底物的濃度，降低生物催化不對稱還原制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的生產成本，其反應條件溫和、操作簡單、耗能少、轉化效率高、產物易于分離、反應過程無污染。本專利技術解決其技術問題所采用的技術方案是本專利技術所述的粘紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa) CCZU-G5,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，位于北京市朝陽區北辰西路I號院中國科學院微生物研究所內，保藏號CGMCC No. 6328，保藏日期2012年7月12日。該粘紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa) CCZU-G5菌落特征和生化特性在光學顯微鏡下菌株呈橢圓形，瓊脂板培養基上呈現出紅色，表面光滑、有光澤，質地粘稠、邊緣整齊。菌株來源本專利技術中所述的微生物菌株粘紅酵母CCZU-G5是從江蘇常州周邊油脂廠、化工廠和學校 食堂周圍采集的80份土樣中篩選得到。將上述粘紅酵母CCZU-G5應用于不對稱催化制備(R) -2-羥基_4_苯基丁酸乙酯中，該應用是以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯為底物，以粘紅酵母CCZU-G5全細胞為生物催化劑，在水/有機溶劑兩相體系中進行微生物不對稱催化還原反應，反應結束后轉化液經過分離純化得到(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。具體按照如下步驟進行的( I)粘紅酵母濕菌體的制備將粘紅酵母CCZU-G5經過活化培養和發酵培養后得到發酵培養液，經過離心得到粘紅酵母CCZU-G5濕菌體，作為全細胞生物催化劑；(2)配制反應體系在有機溶劑與pH 5 9的磷酸鹽緩沖液配制成反應體系中，加入濃度為20 100g/L的2-氧代-4-苯基丁酸乙酯作為底物，再加入一定量的輔助底物；(3)生物催化反應在步驟(2)的反應體系中加入步驟(I)所述濕菌體，在反應溫度為20 50°C，搖床轉速100 250r/min條件下反應I 30h ;(4)轉化液后處理在步驟(3)的生物催化反應后轉化液經過離心分離菌體，取出上層有機相，下層水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液和有機相，再干燥脫水過夜，將有機相用濾紙過濾，收集有機相，旋轉蒸發回收溶劑，得到無色油狀液體(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。作為對本專利技術的限定，在上述步驟(I)中活化培養是按以下步驟進行的將活化培養基的各組分按照以下濃度配制葡萄糖10 100g/L,蛋白胨10 100g/L,酵母粉 10 100g/L，pH自然；115°C滅菌30分鐘，滅菌后冷卻，接入斜面種子，在20 40°C，搖床轉速100 250r/min的條件下培養I 5天，作為活化培養種子液。在上述步驟(I)中發酵培養液是按以下步驟制備的將發酵培養基的各組分按照濃度濃度配制葡萄糖10 100g/L,蛋白胨10 100g/L，酵母粉10 100g/L,MgSO4O.1 lg/L, (NH4)2SO4O.1 Ig/L, K2HPO4 ·3Η20 O.1 lg/L, KH2PO4O.1 lg/L，pH 5 9，115。。滅菌30分鐘，滅菌后冷卻，按接種量體積比3 10%接種活化培養種子液，在溫度20 40°C， 搖床轉速100 250r/min的條件下培養I 5天后，得發酵培養液。在上述步驟(2)中所述的有機溶劑是乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷、壬烷或癸烷中的一種，上述產品均為市售分析純；在用有機溶劑與PH 5 9的磷酸鹽緩沖液配制成反應體系時，按有機溶劑的體積百分濃度為5 80%配制成水/有機溶劑兩相體系，其中水相即指磷酸緩沖溶液。所述的磷酸緩沖溶液采用本領域常規的配制方法配制即可。微生物催化的不對稱還原反應通常需要輔酶的參與，微生物全細胞尤其是酵母細本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種粘紅酵母CCZU?G5，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期2012年7月12日，保藏編號CGMCC?No.6328。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王利群，汪云，汪慶，何玉財，卿青，朱劼，王明慧，
申請(專利權)人：常州大學，
類型：發明
國別省市：
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