本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了一種人源抗人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）抗體及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)通過(guò)基因工程手段和噬菌體表面展示技術(shù)，從全合成單鏈人抗體庫(kù)中篩選出抗人EGFR的基因工程單鏈抗體，并獲得其抗體的可變區(qū)基因序列，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建全人單克隆抗體，進(jìn)一步獲得高純度抗體蛋白。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的抗體與人EGFR結(jié)合的親和力不小于1nM，其突變體親和力不小于10nM；并完成了抗體蛋白IgG的免疫活性和生物活性鑒定，證實(shí)抗體具有良好的抑制EGFR高表達(dá)細(xì)胞A431荷瘤模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)活性，本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)為針對(duì)EGFR靶標(biāo)的抗腫瘤及其他疾病如炎癥及自身免疫性疾病的預(yù)防和治療提供了特異性抗體藥物。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及治療用人源基因工程抗體的制備及應(yīng)用，主要是涉及特異性針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體(epidemic growth factor receptor,EGFR)的抗體及其編碼基因與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是表皮生長(zhǎng)因子基因(erbB)家族的一員，在多種腫瘤如乳腺癌，結(jié)腸癌，頭頸腫瘤，腎癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌的發(fā)展中均具有重要影響。國(guó)內(nèi)外許多研究表明，針對(duì)EGFR的抗體可有效地在胞外通過(guò)阻斷配體的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制，對(duì)多種由EGFR過(guò)度表達(dá)或/和突變所引起的人體腫瘤，尤其是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(80% 100%)、結(jié)直腸癌(25% 77%)、非小細(xì)胞型肺癌(40% 80%)等有較好的療效。表皮生長(zhǎng)因子受體是目前研究得較深入且倍受關(guān)注的腫瘤治療靶點(diǎn)之一，應(yīng)用基因工程手段研制抗EGFR的單克隆抗體，是目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)之一。目前已經(jīng)有2株抗EGFR的治療性抗體獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)，分別是針對(duì)EGFR的鼠-人嵌合抗體西妥昔單抗(cetuximab,商品名為愛(ài)必妥)和全人抗體帕尼單抗(panitumumab),用于結(jié)直腸癌和頭頸部腫瘤治療。2005年,抗EGFR的人源化抗體尼莫珠單抗(nimotuzumab,商品名為泰欣生)獲得了我國(guó)藥監(jiān)局(SFDA)批準(zhǔn)的I類(lèi)新藥證書(shū)。針對(duì)該IE標(biāo)的在研抗體包括人源化單抗pertuzumab、人源抗體zalutumumab和Necitumumab等。其結(jié)合的抗原表位不盡相同，但均能夠發(fā)揮抑制EGFR介導(dǎo)的生物學(xué)功能。人抗體是治療性抗體發(fā)展的最終方向，臨床上應(yīng)用人抗體可最大限度減少抗體的免疫原性、延長(zhǎng)抗體在體內(nèi)的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fe段介導(dǎo)免疫調(diào)理、ADCC及CDC效應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)抗體的生物學(xué)效應(yīng)。人抗體的主要研制手段包括抗體庫(kù)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)。目前，大容量抗體庫(kù)技術(shù)已經(jīng)非常成熟，尤其是噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了多株全人抗體的成功上市。在已構(gòu)建的大容量抗體庫(kù)中，CAT公司的半合成抗體庫(kù)和Marphosys AG公司的全合成抗體庫(kù)是最具代表性和最為成功的代表。尤其是通過(guò)Marphosys AG公司的HuCAL GOLD技術(shù)已經(jīng)獲得了數(shù)十株具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的候選抗體，目前進(jìn)入臨床階段的有17個(gè)項(xiàng)目。該技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)在于可以通過(guò)合理設(shè)計(jì)對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)，其抗體框架基因?yàn)榭商鎿Q的盒式結(jié)構(gòu)，便于后期的抗體優(yōu)化和改造，基于這一優(yōu)勢(shì)，HuCAL庫(kù)目前已經(jīng)將其抗體庫(kù)更新至第三代，庫(kù)容量達(dá)到4. 5X101(I，從抗體庫(kù)中可篩選到親和力達(dá)到PM水平的高親和力抗體。因此，目前在技術(shù)上利用抗體庫(kù)技術(shù)獲得治療性人抗體已經(jīng)非常成熟，被認(rèn)為是目前最成功的開(kāi)發(fā)治療性抗體的技術(shù)手段之一。申請(qǐng)人通過(guò)技術(shù)優(yōu)化和探索，專(zhuān)利技術(shù)了一種高效的DNA連接和轉(zhuǎn)化的方法，并將其用于大容量噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建了庫(kù)容量達(dá)到1. 35 X IO10的大容量全合成噬菌體單鏈人抗體資源庫(kù)(ZL. 200910091261. 8)，并利用該抗體庫(kù)篩選獲得了多個(gè)針對(duì)不同靶標(biāo)的特異性抗體。本專(zhuān)利技術(shù)所獲得的抗體Ame55即為從抗體庫(kù)中篩選獲得
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)提供了用于治療和預(yù)防與EGFR表達(dá)相關(guān)的疾病，特別是表達(dá)EGFR的腫瘤和自身免疫性疾病的抗體治療。本專(zhuān)利技術(shù)的第一個(gè)目的在于提供一種人源抗EGFR抗體及其活性片段的氨基酸序列。本專(zhuān)利技術(shù)的第二個(gè)目的在于提供編碼上述抗體或其活性片段的基因。本專(zhuān)利技術(shù)的第三個(gè)目的在于提供上述抗體及其活性片段在制備治療高表達(dá)/過(guò)度表達(dá)EGFR的惡性腫瘤和自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)運(yùn)用噬菌體表面展示技術(shù)，從大容量全合成人源單鏈抗體庫(kù)中，通過(guò)多輪的生物淘洗(bio-panning),篩選獲得特異性抗人EGFR的單鏈基因工程抗體(singlechain variable fragment, scFv)。在本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例中，將上述抗體輕重鏈可變區(qū)分別導(dǎo)入 全抗體哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)載體PABL和pABGl中，通過(guò)共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)分泌表達(dá)，得到全抗體Ame55。本專(zhuān)利技術(shù)提供的抗體可變區(qū)氨基酸序列模式為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在此，F(xiàn)Rl 4代表4個(gè)框架區(qū)域，⑶Rl 3代表3個(gè)高變區(qū)。FRl 4可以是從恒定區(qū)序列分離而來(lái)(比如人免疫球蛋白輕重鏈類(lèi)、亞類(lèi)或亞家族最常用的氨基酸)，也可以是從個(gè)人抗體框架區(qū)分離而來(lái)或從不同的框架區(qū)基因組合而來(lái)。例如Kabat等庫(kù)中收錄的眾多人抗體框架區(qū)序列。其中，重鏈可變區(qū)為人免疫球蛋白亞群人重鏈VH V家族，輕鏈可變區(qū)為L(zhǎng)ambdaIII家族。關(guān)于輕重鏈的CDR區(qū)，通過(guò)丙氨酸掃描及其他同類(lèi)氨基酸突變，獲得大量突變體，對(duì)輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的突變體評(píng)價(jià)結(jié)果表明CDRLl序列為SOTX1LGDKYX2X3 (SEQ IDNO I)在此，Xl可以是Ala、Gly、Asn、Lys，優(yōu)選為L(zhǎng)ys和Gly ；X2可以是Ala、Val和He，優(yōu)選為 Ala ;X3 可為 Ser 和 Tyr，優(yōu)選為 Ser。CDR2L 序列為EDX1KRPS(SEQ ID NO 2)，在此，Xl可以是 Ser、Thr、Ala 和 Gly，優(yōu)選為 Ser。CDRL3 序列可以是X1X2WDX3DWX4MP (SEQ ID NO3),在此,Xl 為 Ser、Ala、Gly、Leu、Asn、Tyr 和 Gin,優(yōu)選為 Ser ；X2 可以是 Val、Ser、Ala 和Leu,優(yōu)選為Ser或Ala ；X3可以是Gly、Ala和Pro，優(yōu)選為Gly ；X4可以是Gly和Ser，優(yōu)選為Gly0對(duì)重鏈CDR2和CDR3的突變體評(píng)價(jià)結(jié)果表明CDRH2序列為X1IIYPX2DSDTRYSPSFQ (SEQID NO 5)，在此，Xl可以是Gly和Ser，優(yōu)選為Gly ;X2可以是Gly和Ser，優(yōu)選是Gly。CDR3H序列為 GIIYPSNVX1V (SEQ ID NO 6)，在此，Xl 可以是 Ala、Ser 和 Gly，優(yōu)選為 Ser 或 Ala。對(duì)該抗體的輕重鏈⑶R區(qū)進(jìn)行丙氨酸掃描，結(jié)果表明，輕重鏈⑶R3及輕鏈⑶Rl和重鏈⑶R2對(duì)抗體與EGFR的結(jié)合至關(guān)重要。僅單個(gè)氨基酸的變化可引起親和力幾倍至幾十倍的改變，具體見(jiàn)實(shí)施例5。本專(zhuān)利技術(shù)提供的人源抗人EGFR抗體，其輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。進(jìn)一步地，其輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO I和SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。更進(jìn)一步地，其輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列。進(jìn)一步地，本專(zhuān)利技術(shù)提供的人源抗人EGFR抗體，其重鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。進(jìn)一步地，其重鏈可變區(qū)還含有如SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列。更進(jìn)一步地，其重鏈可變區(qū)含有如SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。本專(zhuān)利技術(shù)提供的人源抗人EGFR抗體，其為單鏈抗體、Fab、微型抗體、嵌合抗體或全抗體免疫球蛋白 IgGl、IgG2、IgA、IgE、IgM、IgG4、IgD。本專(zhuān)利技術(shù)提供的人源抗人EGFR抗體Ame55，其重鏈可變區(qū)來(lái)自Vh5，其輕鏈可變區(qū)來(lái)自Va3，其抗體亞型為IgGl本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種人源抗人EGFR抗體，其特征在于，其輕鏈可變區(qū)含有如SEQ?ID?NO?3所示的氨基酸序列。
【技術(shù)特征摘要】
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫志偉，王雙，孫久如，張暢，曾大地，仇瑋祎，常紅艷，范志和，楊濤，范鐵炯，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：上海賽倫生物技術(shù)有限公司，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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