本發明專利技術涉及一種鴨坦布蘇病毒E蛋白多克隆血清及應用。本發明專利技術以純化的鴨坦布蘇病毒的重組E蛋白作為抗原注射新西蘭大耳白兔獲得多克隆血清，具有較好的免疫保護效果。將5日齡和35日齡的DTMUV陰性麻鴨注射多克隆血清后，對黃病毒的攻毒保護率分別達到100%和90%。用對開發敏感性高、特異性強的鴨坦布蘇病毒保護性抗體血清提供實驗基礎和較大的市場價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于家禽基因工程
，具體涉及。
技術介紹
2010年4月以來，我國主要蛋鴨養殖區福建、山東、浙江、上海、江蘇等地陸續暴發一種以蛋鴨、種鴨產蛋驟然大幅下降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性傳染病，造成約1. 2億只蛋鴨和1500萬只肉鴨發病，經濟損失達數十億元。隨著病原學研究的深入，該病被確診是由一種新型黃病毒鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的。鑒于當前如此嚴峻的形勢，建立鴨坦布蘇病毒抗體對該病的主動免疫保護 和流行病學調查具有極其重要的意義。研究發現，鴨坦布蘇病毒編碼結構蛋白(C、PrM和E)和非結構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)。其中，E蛋白在病毒受體結合、侵入和融合方面起到了關鍵的作用，是病毒的主要結構蛋白，具有較好的免疫原性，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原，也成為了宿主抗感染免疫的重要保護性抗原。因此，篩選新的E蛋白等位基因進行疫苗研發無疑具有重要的現實意義和市場開發價值。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種，即以新的鴨坦布蘇病毒E蛋白基因作為免疫原產生的多克隆血清抗體，保護動物免受鴨坦布蘇病毒的感染。本專利技術多克隆抗體，是以氨基酸序列為SEQ ID NO 1的鴨坦布蘇病毒E蛋白為免疫原制備的。上述的多克隆抗體的制備方法，包括如下的步驟I)取鴨坦布蘇病毒E蛋白添加到弗氏完全佐劑中至濃度為lmg/ mL,混均后制成乳劑來免疫新西蘭大耳白兔；2)在第一次免疫后，每隔一周加強免疫一次，其中第二、三次免疫在乳劑中添加弗氏不完全佐劑，第四次注射抗原溶液；3)自第一次免疫后的第五周起取血，室溫下待血清完全分離，離心后的血清經過純化后獲得為本專利技術制備的鴨坦布蘇病毒多克隆抗體。本專利技術制備的多克隆抗體用于預防鴨坦布蘇病毒病。本專利技術以純化的鴨坦布蘇病毒的重組E蛋白作為抗原注射新西蘭大耳白兔獲得多克隆血清，具有較好的免疫保護效果。將5日齡和35日齡的DTMUV陰性麻鴨注射多克隆血清后，對黃病毒的攻毒保護率分別達到100%和90%。用對開發敏感性高、特異性強的鴨坦布蘇病毒保護性抗體血清提供實驗基礎和較大的市場價值。具體實施例方式下面結合具體實施方式來進一步描述本專利技術，但本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本專利技術的技術方案的情況下可以對本專利技術的技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本專利技術保護范圍內。一、鴨坦布蘇病毒E基因的擴增將臨床分離疑似DTMUV的病料處理后接種SPF雞胚盲傳三代后，PCR擴增鴨坦布蘇病毒E基因全長，引物序列如下E-F: 5， AGAATTCATGTTCAGCTGTCTGGGGA， 3 (EcoR I)E-R: 5’ ACTCGAGTTAATTGACATTTACTGCCAGG ’3 (Xho I) 按以下參數在PCR儀上進行反應98 °C預變性30 S，然后以98 V 10 S、55 V15 s、72 °C I min進行25個循環。擴增產物進行測序后將E蛋白基因序列(SEQ ID NO :2)在NCBI上Blast比對，同源性最高為97%，表明擴增的樣品為新的病毒株。其翻譯的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。同時，對同一 DTMUV的病料感染的不同SPF雞胚，按照上述記載的條件進行擴增，擴增出的基因測序結果都一致，證明沒有在擴增過程中產生堿基的錯誤。將E蛋白基因的核苷酸(SEQ ID NO :2)5'端和3'端分別加上EcoR I和Xho I酶切位點，送基因公司進行全基因合成 二、基因工程蛋白表達載體的構建與工程菌的獲得1、E基因片段連接到pET_28a(+)載體上并轉化DH5a感受態細胞(I)合成的E基因與pET_28a (+)載體質粒分別利用EcoR I和Xho I酶進行雙酶切。(2)酶切后目的片段的回收雙酶切產物通過1%瓊脂糖回收膠。(3)連接反應根據載體片段與插入片段摩爾數比為1: 2 10的原則，設計連接體系，16 °C連接過夜。(4)連接產物轉化E. coli DH5a感受態細胞，37 1孵箱培養過夜。(5)陽性轉化子的篩選與鑒定陽性克隆的測序由華大基因公司完成，將測序后的序列與標準合成序列進行核酸序列的Blast分析，與改造后的E蛋白基因的核苷酸(SEQ ID NO :2)完全一致。因此，將構建完成質粒命名為pET-28a(+)-E。2. pET-28a(+)_E 質粒轉化 E. coli BL21(DE3)感受態細胞(l)pET-28a(+)_E 質粒的提取。(2)pET-28a(+)_E 質粒轉化 BL21(DE3)感受態細胞。(3)挑一株陽性克隆命名為BL21-pET-28a(+)_E菌株。三、發酵、純化與鴨坦布蘇病毒E蛋白制備(I) LB培養基作為種子培養基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 7H20的LB培養基作為發酵培養基，補料為葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10 g/L, NaCl 5 g/L、MgSO4 7H20 5 g/L。(2)發酵過程挑取鑒定過的工程菌接種于含卡那霉素的濃度為50y g/ml的LB培養基，37°C振蕩培養8小時，作為種子液。將種子液按2%接種量接種于發酵罐中，調節好各參數，37°C，200轉，溶氧控制在20%以上。發酵4小時后開始流加補料，發酵6小時后加入0. 3mmol/LIPTG進行誘導表達，表達后6小時發酵結束。(3)鎳柱純化、脫鹽(4)親和層析采用鎳離子金屬螯合層析柱，重組蛋白可以用含300mmol/L咪唑的洗脫液洗下來，純度達到90%以上(5)脫鹽收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外液，透析脫鹽即得重組蛋白液。·四、多克隆血清的制備(I)動物選擇新西蘭大耳白兔兩只。( 2 )接種途徑皮下注射。(3)接種部位脊背，左右腳足墊，左右腹股溝。(4)佐劑使用弗氏完全佐劑(CFA)，弗氏不完全佐劑(IFA)為Sigma公司產品。(5)接種策略I)每只大耳白兔抗原免疫用量1.0 mg。取2. 5 mg E蛋白加弗氏完全佐劑2. 5 mL,順時針方向研磨直至形成“油包水”樣乳劑。2)固定大耳白兔，75 %乙醇消毒，分別在脊背，左右腳足墊，左右腹股溝皮下注射乳化液，注射量2 mL/只。3)每隔一周加強免疫一次，其中第二、三次加弗氏不完全佐劑，第四次注射抗原溶液。4)第五周起于兔耳緣靜脈取血將新西蘭大耳白兔輕輕放入固定架上，二甲苯涂于耳緣靜脈的上中部，用刀片傾斜45度在該處切出0. 2-0. 3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在結束之前出現凝固可用溫水輕擦切口處，再繼續收集。收集適量血液后可用消毒后的紗布輕擦患處，請按患處10-20秒確定血流停止方可結束。將血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘，在4°C放置過夜。用藥鏟將血凝塊從管壁上拔落，將血液轉移至塑料離心管中，4°C 10，OOOg離心10分鐘，收集上清液即為抗血清。(6)抗體純化首先是準備BDV磷蛋白(P24) sepharose CL-4B親和柱。通常準備5mL或IOmLBDV磷蛋白(P24) sepharose CL-4B填料，在真空瓶中等體積的填料和TBS緩沖液混合，攪拌。抽真空約1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鴨坦布蘇病毒多克隆抗體，是以氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的鴨坦布蘇病毒E蛋白為免疫原制備的。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：魏波，凌紅麗，徐麗麗，
申請(專利權)人：青島寶依特生物制藥有限公司，青島康地恩藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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