本發(fā)明專利技術(shù)公開了松材線蟲(Bursaphelenchus?xylophilus)的玻璃化冷凍保存及解凍復(fù)蘇方法，該方法包括以下步驟：(1)將松材線蟲懸液與冷凍保護(hù)劑混合均勻得到混合物；將混合物進(jìn)行平衡處理；(2)平衡處理后的混合物在液氮中冷凍保存；(3)解凍、復(fù)蘇；其中，所述的冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜和卵黃。本發(fā)明專利技術(shù)對(duì)玻璃化冷凍保存方法中的各工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，篩選到了最適宜于松材線蟲玻璃化冷凍保存的保護(hù)劑的種類、濃度以及包括預(yù)處理、平衡和解凍復(fù)蘇在內(nèi)的最適宜的處理方式。采用本發(fā)明專利技術(shù)方法冷凍保存松材線蟲，冷凍后的松材線蟲存活率高、凍后繁殖率高，能適用于松材線蟲不同株系的冷凍保存。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)的冷凍保存方法,尤其涉及，屬于松材線蟲的冷凍保存領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是松材線蟲病的病原物,屬于側(cè)尾腺口綱，墊刃目，滑刃超科，滑刃科，傘滑刃線蟲屬。松樹是中國(guó)的主要造林樹種且其中許多種類是感病的，全中國(guó)一半以上省份的氣候適合松材線蟲病的發(fā)生，在中國(guó)大部分地區(qū)具備成災(zāi)和流行的基本條件，是中國(guó)林業(yè)和生態(tài)環(huán)境建設(shè)的心腹大患。松材線蟲病又名松材線蟲萎蔫病、松樹萎蔫病、松樹枯萎病，是松屬樹種的一種毀滅性的病害，因其危害嚴(yán)重且防治非常困難而被世界上許多國(guó)家列為檢疫對(duì)象。松材線蟲危害黑松(Pinus thunbergii)、赤 松(P. sylvestris)、馬尾松(P. massoniana)和濕地松(P. elliottii)等多種松樹，被稱為松樹的“癌癥”。自發(fā)現(xiàn)松材線蟲病以來，國(guó)內(nèi)外就展開了大量研究，一直在不斷地探索其防治措施。松材線蟲的低溫冷凍保存能夠充分利用并收集各種來源的松材線蟲，可為松材線蟲的致病機(jī)理和生物防治技術(shù)的研究和應(yīng)用提供大量實(shí)驗(yàn)材料，并且不受時(shí)間和空間的限制。線蟲種質(zhì)資源的提供與保存作為整個(gè)研究中最為基礎(chǔ)的一個(gè)環(huán)節(jié)，將受到人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?。松材線蟲的實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)保存方法是將松材線蟲連同培養(yǎng)基置于(4_8°C )冰箱中保存，雖然比較有效，但因受到溫度和濕度的限制，不能滿足商業(yè)化制劑的要求和需要，很難進(jìn)入商品化生產(chǎn)階段，也由于人力和物力上的巨大消耗，難于在實(shí)驗(yàn)室作為種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的方法。受細(xì)胞凍存的啟發(fā)，低溫凍存也開始應(yīng)用于線蟲學(xué)方面。為了尋找線蟲低溫保存技術(shù)，各國(guó)學(xué)者從十九世紀(jì)二十年代就開始進(jìn)行低溫保存技術(shù)的研究，Rahm在1921年和1922年進(jìn)行了 Plecus rhizophilus和P. parietinus線蟲種的低溫忙藏試驗(yàn)，在窒息條件下，Plecus spp.暴露在_272°C幾個(gè)小時(shí)、暴露在_192°C 5d,仍可存活。試驗(yàn)中Rahm發(fā)現(xiàn)Plecus spp.線蟲慢慢在水中冷凍條件下,在_253°C,最多可存活24h。后來DeConinck又進(jìn)行了 Anguillula silusiae線蟲_196°C的液氮冷藏試驗(yàn),他發(fā)現(xiàn)在不加保護(hù)劑條件下，A. silusiae線蟲經(jīng)_30°C和_196°C兩步處理時(shí)，可獲得3齡和4齡幼蟲5%的存活率。冷凍保護(hù)劑(cryoprotective agents, CPA)是指某一類化合物,可以保護(hù)細(xì)胞抵抗低溫或超低溫對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損害，如細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰、脫水、溶質(zhì)濃度提高和蛋白質(zhì)變性及其骨架結(jié)構(gòu)的損傷等，這類化合物稱作冷凍保護(hù)劑。冷藏試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑溶液是影響冷凍效果的重要因素。根據(jù)能否滲透進(jìn)入細(xì)胞，可將冷凍保護(hù)劑分為滲透性和非滲透性兩種。此外，還有一些新的冷凍保護(hù)劑，如抗凍蛋白、植物類抗凍因子等。不同線蟲屬之間或同一屬內(nèi)不同種之間對(duì)冷凍保護(hù)劑的反應(yīng)存在著很大差別。九十年代以后，科學(xué)家們更注重冷凍技術(shù)的研究，根據(jù)冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶，凍存方法可分為玻璃化和非玻璃化兩種。玻璃化冷凍即應(yīng)用高濃度的冷凍保護(hù)劑溶液在超速冷凍過程中，形成一種極其粘稠的固化狀態(tài)，從而避免細(xì)胞內(nèi)冰晶形成的一種冷凍技術(shù)。重要的是，玻璃化過程完全避免了冷凍細(xì)胞的在解凍直至恢復(fù)細(xì)胞生物活性中冰晶的形成。玻璃化冷凍是指超快速降低細(xì)胞溫度的一種冷凍模式，一般是將經(jīng)過冷凍保護(hù)劑平衡后的線蟲直接由零度以上溫度浸入液氮中保存，避免了細(xì)胞內(nèi)冰晶形成所致化學(xué)、物理損傷，同時(shí)縮短了冷凍處理所需的時(shí)間，簡(jiǎn)化了步驟，也不需昂貴的程序降溫儀；但是，高濃度的保護(hù)劑也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成巨大損傷。因此，玻璃化法研究的重點(diǎn)是尋找容易實(shí)現(xiàn)玻璃化并且對(duì)生物材料毒性較小的冷凍劑，還要更進(jìn)一步地提高冷凍和解凍速率。玻璃化凍存法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷，不必使用貴重的程序控溫儀器，實(shí)用性強(qiáng)且應(yīng)用范圍廣泛；另外，玻璃狀的粘稠固體能夠使其在冷凍時(shí)不會(huì)形成冰晶，減少了生物材料受到的化學(xué)和物理損傷，從而提高存活率。玻璃化冷凍采用的保護(hù)劑濃度遠(yuǎn)高于常規(guī)冷凍的濃度，目的是為了使玻璃化液在冷凍過程(由零度以上溫度浸入液氮)中，由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N類似“玻璃”的非結(jié)構(gòu)狀態(tài)，但沒有冰晶形成，所形成的“玻璃”結(jié)構(gòu)保持著液態(tài)時(shí)正常的離子分布，維持了正常的超微·結(jié)構(gòu)，減少了對(duì)蟲體及細(xì)胞損害，提高了冷凍復(fù)蘇率和繁殖率?？梢姡岣弑Ｗo(hù)劑的濃度能夠促進(jìn)玻璃化的形成，減少冰晶的損傷，但是過高的保護(hù)劑濃度又會(huì)對(duì)線蟲造成滲透損傷，毒性致死。因此，必須在二者之間尋求到一種平衡，使得線蟲在該濃度的處理下冷凍效果最佳?，F(xiàn)有的松材線蟲的冷凍保存及解凍方法均不同程度的存在著凍后存活率較低的缺陷，有待改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種凍后存活率高的松材線蟲玻璃化冷凍保存及解凍復(fù)蘇方法；本專利技術(shù)的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，包括以下步驟(I)將松材線蟲懸液與冷凍保護(hù)劑混合均勻得到混合物；將混合物進(jìn)行平衡處理；(2)平衡處理后的混合物在液氮中冷凍保存；(3)解凍、復(fù)蘇；其中，所述的冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜和卵黃?，F(xiàn)有的冷凍保護(hù)劑的種類較多，采用不同種類、不同用量的冷凍保護(hù)劑，其對(duì)于松材線蟲的冷凍保存效果存在著顯著性的差異；為了篩選出適宜于松材線蟲冷凍保存的冷凍保護(hù)劑，本專利技術(shù)進(jìn)行了冷凍保護(hù)劑的優(yōu)化篩選試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于其它的冷凍保護(hù)齊U，采用二甲基亞砜(DMSO)和卵黃作為松材線蟲的冷凍保護(hù)劑，冷凍后的保護(hù)效果最好，由此，本專利技術(shù)優(yōu)選二甲基亞砜(DMSO)和卵黃作為松材線蟲的冷凍保護(hù)劑。卵黃是禽鳥或爬行動(dòng)物的卵的內(nèi)部貯藏養(yǎng)料、呈黃色的球形體，外部圍有蛋白。卵黃是專供卵生和卵胎生動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本專利技術(shù)中所述的“卵黃”可以是任何一種禽鳥或爬行動(dòng)物所產(chǎn)卵的卵黃，例如可以是雞鴨等家禽動(dòng)物的卵黃，其制備方法可以是將雞蛋或鴨蛋煮熟后，取出其中的卵黃即可。在此基礎(chǔ)上，本專利技術(shù)通過進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑的濃度或用量對(duì)于松材線蟲冷凍后存活率的影響非常顯著；本專利技術(shù)通過優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，控制冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜在混合物中的終濃度是2% -5% (v/v)，控制卵黃在混合物中的終濃度是15% -25% (g/ml)時(shí)，經(jīng)過液氮冷凍后的松材線蟲的存活率較高，其中，當(dāng)二甲基亞砜在混合物中的終濃度是4% (v/v)，卵黃在混合物中的終濃度是20% (g/ml)時(shí)，松材線蟲在液氮中冷凍保存I個(gè)月后的凍后存活率達(dá)到了 61.9±0. 7%。本專利技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在確定“2-5 % 二甲基亞砜+15-25 %卵黃”作為松材線蟲的冷凍保護(hù)劑的基礎(chǔ)上，本專利技術(shù)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步添加不同濃度的清蛋白對(duì)于松材線蟲的凍后效果也有著較為顯著的影響。清蛋白又稱白蛋白。是一類不被50%飽和度的硫酸銨溶液沉淀的球狀蛋白質(zhì)，存在于動(dòng)物組織、體液和某些植物的種子中，其分子量較低，溶于水，易結(jié)晶。在中性溶液中加熱即沉淀或凝固；清蛋白的重要代表是血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、麥清蛋白、豆清蛋白及有毒的蓖麻蛋白。 為了篩選出白蛋白的最適宜的保護(hù)濃度，本專利技術(shù)以“4%二甲基亞砜+20%卵黃”的組合作為主要冷凍保護(hù)劑，分別添加不同濃度的清蛋白以觀察不同用量的清蛋白對(duì)松材線本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
松材線蟲(Bursaphelenchus?xylophilus)的玻璃化冷凍保存及解凍復(fù)蘇方法，包括以下步驟：(1)松材線蟲懸液與冷凍保護(hù)劑混合均勻得到混合物；將混合物進(jìn)行平衡處理；(2)平衡處理后的混合物在液氮中冷凍保存；(3)解凍、復(fù)蘇；其中，所述的冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜和卵黃。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王曦茁，張永安，汪來發(fā)，樸春根，田國(guó)忠，林彩麗，李永，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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