生產(chǎn)高效價(jià)、高純度的病毒母液的方法及使用其的方法技術(shù)

用于病毒清除研究的病毒母液的純度和效價(jià)對(duì)研究結(jié)果具有重要影響，且影響縮尺模型可以多好地代表生產(chǎn)規(guī)模方法。病毒母液中的雜質(zhì)在測(cè)試小病毒保持性過濾器的過程中尤為重要，因?yàn)檫@些雜質(zhì)可能引起過濾器過早地結(jié)垢，導(dǎo)致過濾器的真實(shí)通量能力被低估以及隨后對(duì)生產(chǎn)規(guī)模單元的尺寸確定不當(dāng)。另外，雜質(zhì)也可通過改變結(jié)垢機(jī)制以及隨后經(jīng)過病毒過濾器的流體傳遞來影響所觀察到的病毒清除程度。本文描述制備、生產(chǎn)和使用具有高效價(jià)的高純度病毒母液的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】相關(guān)申請(qǐng)案本申請(qǐng)案要求2010年4月14日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/324，220號(hào)的權(quán)益。以上申請(qǐng)案的全部教示內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
技術(shù)介紹
生物醫(yī)藥產(chǎn)品(例如單克隆抗體、重組蛋白、疫苗、血液衍生物和畜產(chǎn)品)攜帶傳播感染性病毒的風(fēng)險(xiǎn)。這是由于來源物質(zhì)可能內(nèi)部受病毒污染。另外，生物醫(yī)藥產(chǎn)品的制造方法易受外部來源的病毒污染。因此，生物醫(yī)藥產(chǎn)品的制造商需要在其制造方法中并入足夠的病毒清除步驟，以確保其產(chǎn)品無污染病毒。安全性和管理規(guī)則要求，生物醫(yī)藥產(chǎn)品的制造方法并入這些病毒清除步驟。對(duì)制造方法中病毒清除步驟的有效性進(jìn)行評(píng)估是必要的。病毒清除評(píng)估的目的是·評(píng)定制造生產(chǎn)方法使?jié)撛诓《疚廴疚锶セ罨?或去除潛在病毒污染物的能力。摻加研究典型地在生產(chǎn)規(guī)模方法的縮尺模型中用于評(píng)估和驗(yàn)證病毒清除步驟。然而，用于病毒清除研究的病毒母液的純度和效價(jià)對(duì)研究結(jié)果具有重要影響。病毒母液的純度和效價(jià)影響縮尺模型可以多好地代表生產(chǎn)規(guī)模方法。例如，病毒母液中的雜質(zhì)會(huì)不利地影響病毒清除步驟中所用的小病毒保持性過濾器的測(cè)試過程。雜質(zhì)由于驗(yàn)證性摻加研究中使用的不純病毒母液而被引入，且不反映生產(chǎn)規(guī)模方法上的典型制造方法。由于雜質(zhì)，測(cè)試単元(例如過濾器)過早地結(jié)垢，展現(xiàn)改變的結(jié)垢條件，并且不利地影響經(jīng)過病毒過濾器的流體傳遞。從而，過濾器的真實(shí)通量容量被低估，這又導(dǎo)致對(duì)生產(chǎn)規(guī)模單元的尺寸確定不當(dāng)。因此，生產(chǎn)規(guī)模単元尺寸過大以彌補(bǔ)驗(yàn)證研究中這一単元的明顯較低性能。這增加了生產(chǎn)成本。另外，這低估了測(cè)試單元在生產(chǎn)方法中清除病毒的實(shí)際能力，因?yàn)椴《灸敢旱男r(jià)通常決定著摻加入測(cè)試物質(zhì)中的病毒的最大可能濃度，當(dāng)所有病毒均被測(cè)試單元有效清除時(shí)，效價(jià)限制了測(cè)試單元的病毒清除要求。當(dāng)前生產(chǎn)病毒母液(例如用于摻加研究)的方法無法生產(chǎn)具有低雜質(zhì)含量的病毒母液。此外，需要具有盡可能高效價(jià)的病毒母液，因?yàn)榭梢约尤霚y(cè)試系統(tǒng)中的病毒摻加物的體積受管理準(zhǔn)則的限制。當(dāng)前的方法無法生產(chǎn)高效價(jià)和高純度的病毒母液。因此，需要制備具有高純度以及高效價(jià)的病毒母液的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本文中描述生產(chǎn)高純度病毒母液的方法，以及通過所述方法生產(chǎn)的病毒和病毒母液。病毒可以是所期望的任何合適的病毒，例如哺乳動(dòng)物病毒或噬菌體。這些病毒母液適合用作例如評(píng)估和/或驗(yàn)證研究中的病毒摻加物。因此，本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例是ー種制備高純度病毒的方法。所述方法包含以下連續(xù)步驟獲得在低蛋白質(zhì)條件下制備的病毒樣品，在合適的緩沖劑中濃縮病毒樣品，以及在病毒樣品中沉淀病毒，使得沉淀的病毒是高純度病毒。在一個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒是高純度病毒母液。在本專利技術(shù)的另ー個(gè)實(shí)施例中，制備高純度病毒的方法包含色譜精制(chromatographic polishing)。在一個(gè)實(shí)施例中，制備高純度病毒的方法包含以下連續(xù)步驟獲得在低蛋白質(zhì)條件下制備的病毒樣品，在合適的緩沖液中濃縮病毒樣品，在病毒樣品中沉淀病毒以及對(duì)沉淀的病毒進(jìn)行色譜精制，從而生產(chǎn)高純度病毒。在一個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒是高純度病毒母液。在一個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒或高純度病毒母液具有低于50ug/ml的蛋白質(zhì)濃度。在另ー個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒或高純度病毒母液具有低于100fg/TCID5(l的蛋白質(zhì)濃度。在一個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒或高純度病毒母液具有低于60fg/TCID5(l的蛋白質(zhì)濃度。在另ー個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒或高純度病毒母液具有低于50fg/TCID5(l的DNA濃度。在一個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒或高純度病毒母液具有低于15fg/TCID5(l的DNA濃度。在另ー個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒或高純度病毒母液具有低于100fg/TCID5(l的蛋白質(zhì)濃度和低于50fg/TCID5(l的DNA濃度。在一個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒或高純度病毒母液具有低于60fg/TCID5(l的蛋白質(zhì)濃度和低于15fg/TCID5(l的DNA濃度。 在另ー個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒或高純度病毒母液具有至少IO6TCID5cZml的病毒濃度。本專利技術(shù)的另ー個(gè)實(shí)施例是ー種評(píng)估和/或驗(yàn)證病毒清除處理和其中所用物質(zhì)的方法?？s尺病毒清除處理是通過使用測(cè)試樣品和分析病毒清除處理的結(jié)果來測(cè)試。病毒清除的量評(píng)估并且決定著病毒清除處理以及病毒清除處理中所用物質(zhì)的驗(yàn)證。如果病毒充分地從測(cè)試樣品中去除來滿足管理標(biāo)準(zhǔn)，那么病毒清除處理以及清除處理中所用物質(zhì)經(jīng)過驗(yàn)證。在一個(gè)實(shí)施例中，評(píng)估和/或驗(yàn)證病毒清除處理的方法包含向樣品中摻加高純度病毒母液，以生產(chǎn)測(cè)試樣品。在一個(gè)實(shí)施例中，高純度病毒溶液包含低于100fg/TCID5(l的蛋白質(zhì)濃度和低于50fg/TCID5Q的DNA濃度。本專利技術(shù)的另ー個(gè)實(shí)施例是在包含向樣品中摻加病毒溶液的方法中評(píng)估和/或驗(yàn)證病毒清除處理的ー種方法，其中病毒溶液是通過包含流通色譜、基于珠粒的色譜、分子排阻處理或基于疏水性的處理的方法來制備。在一個(gè)實(shí)施例中，病毒溶液是通過陽離子交換流通色譜來制備。在另ー個(gè)實(shí)施例中，病毒溶液是通過陰離子交換流通色譜來制備。在一個(gè)實(shí)施例中，流通色譜包含在膜或基于珠粒的基質(zhì)上的陽離子交換流通色譜。在一個(gè)實(shí)施例中，評(píng)估和/或驗(yàn)證病毒清除處理和其中所用物質(zhì)的方法包含向樣品中摻加高純度病毒母液，所述病毒母液包含至少107TCID5(l/ml的病毒、低于100fg/TCID5Q的蛋白質(zhì)濃度和低于50fg/TCID5(l的DNA濃度。附圖說明圖I是概括的病毒生產(chǎn)方案和特異性小鼠微小病毒(MVM)生產(chǎn)方法的一個(gè)實(shí)例的方框圖。圖2是展示本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例的流程圖。圖3A到圖3C說明本專利技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例。圖3A是在樣品病毒制備方法中的不同階段取出的樣品的銀染色SDS-PAGE凝膠。泳道1、14和15是標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記。泳道2是在第3天的MVM感染的細(xì)胞培養(yǎng)基的樣品，緊接著將所述培養(yǎng)基從具有1%胎牛血清(FBS)的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)改變成無血清的DMEM。泳道3是在第14天感染完成時(shí)混合細(xì)胞裂解液的樣品。泳道4是澄清裂解液的樣品。泳道5是來自用于病毒濃縮的超濾(Centricon )的濾液樣品。泳道6是來自用于病毒濃縮的超濾的稀釋過的滯留物樣品。泳道7是在通過超速離心進(jìn)行病毒沉淀后的上清液樣品。泳道8是在通過超速離心進(jìn)行病毒沉淀后的病毒顆粒樣品。泳道9是在通過超速離心進(jìn)行病毒沉淀和經(jīng)過O. 22微米過濾器過濾后的病毒顆粒樣品。泳道10和12是使用陽離子交換(CEX)膜吸附劑進(jìn)行色譜精制時(shí)的早期部分的樣品，所述陽離子交換(CEX)膜吸附劑包含通過聚醚砜(PES)基質(zhì)上的MBAm (N, N’ -亞甲基雙丙烯酰胺)交聯(lián)的AMPS (2-丙烯酰胺基-2-甲基-I-丙磺酸)。泳道11和13是使用CEX膜吸附劑進(jìn)行色譜·精制時(shí)的后期部分。圖3B由維爾王(Willwand)等人，病毒學(xué)雜志(J Virol) (1993) 67:5660改編而來，其展示MVM衣殼蛋白VPl的分子大小是83kDa并且MVM衣殼蛋白VP2的分子大小是64kDa。在最終純化過的病毒產(chǎn)品(圖3A)中通過銀染色SDS-PAGE明顯可見的兩個(gè)主要蛋白色帶具有與已知MVM病毒殼體蛋白VPl和VP2相同的大小并以相同的比例呈現(xiàn)，這表明極純病毒母液中主要?dú)埩舻鞍资遣《径请s質(zhì)。圖3C是對(duì)應(yīng)于圖3A中的SDS-PAGE凝膠的泳本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戴蒙·R·亞瑟，亞曼達(dá)·B·卡茲，納維德·Z·坎恩，烏許瑪·梅塔，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：EMD密理博公司，
類型：
國別省市：