人類神經前體細胞向多巴胺神經元的分化方法及用于分化的培養基技術

本發明專利技術提供一種人類神經前體細胞向多巴胺神經元的分化方法，該方法包括：在含有萎蔫酸的培養基中培養人類神經前體細胞。此外，本發明專利技術提供一種用于人類神經前體細胞向多巴胺神經元分化的培養基。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及一種人類神經前體細胞向多巴胺神經元的分化方法，更詳細地涉及一種包括以下步驟的人類神經前體細胞向多巴胺神經元的分化方法，所述分化方法包括在含有萎蔫酸(fusaric acid)的培養基中培養人類神經前體細胞。此外,本專利技術涉及用于人類神經前體細胞向多巴胺神經元分化的培養基。
技術介紹
帕金森疾病的特征在于，中腦黑質體(substantia nigra)部位的多巴胺神經元(dopaminergic neurons)選擇性地退化。人們正在對通過移植胎兒的中腦組織(fetal midbrain tissue)來取代帕金森疾病患者的多巴胺神經元的治療方法進行廣泛的研究(參見文獻I)。移植的胎兒中腦組織在人腦中長期存活，同時對患者的紋狀體(striatum)上的多巴胺神經分布進行修復，并減少伴隨帕金森疾病的運動癥狀(motor symptoms)(參見文獻2)。雖然上述移植在用于帕金森疾病的治療方面會有效，但由于難以大量獲得人類流產胎兒組織(abortionfetal tissues),因此其臨床上的應用被限定在極少數的情況。為了克服這些問題，一直將各種細胞用作治療帕金森疾病的后補供體細胞進行研究(參見文獻3)?！矫妫捎趤碜蕴褐心X組織的人類神經前體細胞(human neural progenitorcells, hNPCs)具有長期的增殖活性，因此其自我增殖能力優異，并且能夠向多巴胺神經元進行分化，可期待將其作為用于移植的細胞源來應用(參見文獻4及5)。由此，在通過取代多巴胺神經元(即，移植)來治療帕金森疾病方面，確立可有效增殖(proliferation或expansion)人類神經前體細胞的方法和使人類神經前體細胞有效分化成多巴胺神經元的方法是非常重要的。能夠使人類神經前體細胞分化成多巴胺神經元的方法如下。將抗壞血酸和二丁酰環單憐酸腺苷(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, db-cAMP)添加到培養基中，分化3天的方法(參見文獻6);將BDNF(腦衍生神經營養因子,Brain-derived neurotrophicfactor)、多巴胺、毛喉素(Forskolin)添加到培養基中，分化3周的方法(參見文獻7);及使用添加有SHH (音猬因子，Sonic hedgehog)、FGF-8 (成纖維細胞生長因子_8，broblastgrowth facter-8)、BDNF及抗壞血酸的培養基分化3周的方法(參見文獻8)等。但是,現有分化方法的分化效率仍然不令人滿意，而且需要很長的分化時間，由于需要使用投入有大量SHH或FGF-8等高價添加劑的培養基，因此經濟上存在困難，并且在治療帕金森疾病患者時，缺乏能夠使所需大量細胞進行增殖的技術，因此在臨床使用方面受到很多限制。
技術實現思路
要解決的技術問題本專利技術提供一種能夠以高分化效率使人類神經前體細胞分化成多巴胺神經元的方法及能夠有效地應用于上述分化的用于分化的培養基。特別地，本專利技術以萎蔫酸作為新型分化誘導劑，提供一種使hNPCs有效地分化成多巴胺神經元的方法及能夠有效地應用于所述分化的用于分化的培養基。由此，本專利技術的目的在于，提供一種在含有新型分化誘導劑的培養基中，使人類神經前體細胞分化成多巴胺神經元的方法。·此外，本專利技術的目的還在于，提供一種對于使人類神經前體細胞分化成多巴胺神經元有用的用于分化的培養基。技術方案 根據本專利技術的一個實施方式，提供一種人類神經前體細胞向多巴胺神經元的分化方法，其包括在含有萎蔫酸的培養基中培養人類神經前體細胞。根據本專利技術的分化方法，所述培養基為在含有二丁酰環單磷酸腺苷、毛喉素、B27、SHH及FGF8的多巴胺神經元分化用培養基中添加萎蔫酸而形成。選擇性地，在本專利技術的分化方法中，所述培養基可以是含有萎蔫酸、db-cAMP、毛喉素及B27的NB培養基，優選地，可以是含有50 u M 4mM萎蔫酸、50 u M 4mM db-cAMP、5 20 u M毛喉素及0. 5飛重量％B27的NB培養基。更優選地，所述培養基可以是含有100 ii M萎蔫酸、100 u M db-cAMP、IOuM毛喉素及2重量％B27的NB培養基。在本專利技術的分化方法中，所述培養優選在氧分壓為2 10%的低氧分壓條件下實施。根據本專利技術的另一實施方式，提供一種用于分化的培養基，其為用于人類神經前體細胞向多巴胺神經元分化的培養基，所述培養基為含有萎蔫酸、db-cAMP、毛喉素及B27的NB培養基。所述用于分化的培養基為含有50 u M 4mM萎蔫酸、50 u M 4mMdb-cAMP、5 20 y M毛喉素及0. 5 5重量％B27的NB培養基，優選地，可以為含有100 u M萎蔫酸、100 u M db-cAMP、IOuM毛喉素及2重量％B27的NB培養基。有益效果本專利技術發現在萎蔫酸存在條件下培養人類神經前體細胞的情況下，能夠顯著地增加向多巴胺神經元的分化。特別是能夠以價格低廉的萎蔫酸作為替代物質，用其代替因價格昂貴而使用受限的高價分化誘導劑SHH及FGF8，從而能夠將人類神經前體細胞分化成多巴胺神經元，因此不僅可以經濟地實施分化步驟，而且可以大大改善以往的分化方法帶來的令人不滿意的分化效率。因此，本專利技術的分化方法可以有效地應用在用于治療包括帕金森疾病的神經損傷疾病的多巴胺神經元的制備上。附圖說明圖I示出了在多種培養基組成中向多巴胺神經元誘導分化后，通過二脒基苯基吲哚(DAPI)染色測定TH及Tuji的結果。圖2示出了增殖hNPCs，在培養基中添加或不添加IOOii M萎蔫酸，向神經元誘導分化后，測定TH及Tuji的表達量的結果。圖3示出了增殖hNPCs，在培養基中添加或不添加IOOii M萎蔫酸，向神經元誘導分化后，實施免疫細胞化學染色分析及RT-PCR分析的結果。圖4示出了在改變分化誘導劑種類的培養基中，向多巴胺神經元誘導分化后，測定分化細胞的TH表達的結果。圖5示出了在低氧(Hypoxia)條件及常氧(Normoxia)條件下測定的分化效率的結果。圖6示出了在MPP存在下誘導分化時，測定萎蔫酸的影響的結果。圖7示出了對hNPCs進行增殖及繼代培養，分別由初期(第7繼代)、中期(第11繼代)及后期(第17繼代)中得到的hNPCs誘導分化后，測定TH表達量及Tuji表達量的結果。圖8示出了對hNPCs進行增殖及繼代培養，分別由初期(第7繼代)、中期(第11繼 代)及后期(第17繼代)中得到的hNPCs誘導分化后，通過對各自細胞的免疫染色，測定TH表達的結果。圖9示出了對hNPCs進行增殖及繼代培養，分別由初期(第7繼代)、中期(第11繼代)及后期(第17繼代)中得到的hNPCs誘導分化后，通過免疫染色，對作為神經干細胞標記的神經巢蛋白、作為增殖性細胞標記的Ki67、及作為成熟神經細胞標記的Tujl的表達進行測定的結果。圖10示出了由增殖初期(第7繼代)hNPCs誘導分化之前和誘導分化后一周時，進行突光輔助細胞篩選分析(FACS analysis)的結果。圖11示出了對hNPCs進行增殖及繼代培養，分別由初期(第7繼代)、中期(第11繼代)及后期(第17繼代)中得到的hNPCs誘導分化后，對所得到的細本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：文之淑，
申請(專利權)人：車醫科學大學校產學協力團，
類型：
國別省市：