EB病毒衣殼抗原IgM抗體膠體金法檢測試劑及其制備方法技術

本發明專利技術公開了一種EB病毒衣殼抗原IgM抗體膠體金法檢測試劑及其制備方法。該試劑包括金結合物墊(3)、硝酸纖維素反應膜(4)、樣品墊(2)、風濕因子處理墊(1)、吸水紙(5)和PVC背襯(8)；風濕因子處理墊約為樣品墊長度的1/2，樣品墊、金結合物墊、硝酸纖維素反應膜和吸水紙順次相互疊壓粘附于PVC背襯上，金結合物墊上包被了抗人IgM單克隆抗體-膠體金的結合物，硝酸纖維素反應膜質控區(7)和檢測區(6)位置上分別包被了羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體和特異性的基因重組EB病毒衣殼抗原。本發明專利技術產品的生產過程簡單易控制，在25分鐘內即可得到檢測結果，且只要按照說明書操作即可實現自我檢測，檢測結果不受風濕因子的影響，靈敏度高、特異性好，結果準確可靠。

【技術實現步驟摘要】
EB病毒衣殼抗原I gM抗體膠體金法檢測試劑及其制備方法
本專利技術屬于醫學檢驗領域，特別是涉及一種用膠體金免疫層析法檢測EB病毒衣殼抗原IgM抗體的試劑及其制備方法。技術背景EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一種嗜人類淋巴細胞的皰疹病毒，主要通過人類唾液傳播，也可經輸血傳染，是皰疹病毒科Y亞科中唯一能夠引起人類感染的淋巴濾泡病毒。EB病毒與包括傳染性單核細胞增多癥、伯基特淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、霍金奇淋巴瘤等有密切的關系，引發了全球癌癥的1%，并占所有感染性癌癥的5. 6%，根據國際癌癥研究署對致癌因子的分類標準，EB病毒被列入第一組致癌因子。人體感染EB病毒后能誘生抗核抗原(EBna)、早期抗原(EA)、衣殼抗原(VCA)、膜抗原(MA)及淋巴細胞識別膜抗原(Iydma)等抗原的相應抗體(IgG、IgA、IgM等抗體)。其中， IgM/VCA抗體出現最早，90 94%的EB病毒感染者在感染初期能夠被檢測到，是EB病毒急性感染，也是復發感染的重要標志，是EB病毒感染的早期診斷不可缺少的重要指標。目前，鼻咽癌的診斷仍須依據內窺鏡和活檢組織病理檢查，但這些方法具有一定的創傷性，在對廣大人群進行篩查時會受到一定的限制。因此，臨床上多采用實驗室診斷方法。常規的EB病毒實驗室診斷方法主要有病毒分離、檢測病毒蛋白質及核酸、EBV血清學實驗檢測抗體等幾種方法。病毒分離法是采用咽漱液直接接種人臍帶血淋巴細胞，根據轉化淋巴細胞的效率來決定病毒的量。該方法耗時并且需要特殊的組織培養條件，故不適合作為常規臨床檢測使用；檢測病毒蛋白質及核酸是，利用核酸雜交和PCR或RT-PCR方法，在病變組織內檢測病毒基因組核酸和病毒基因組轉錄產物，在檢測條件和技術等方面要求較高，故臨床常規檢測中不宜采用；血清學診斷主要通過酶聯免疫法等方法檢測血清中是否存在抗VCA-IgM/IgA抗體、抗核抗原(EBNA)抗體等特異性抗體，由于其具有靈敏度高、特異性好和易于操作等優點，是目前實驗室最常用的方法之一，對疾病的診斷有一定的參考價值。目前，國內外對EB-VCA-IgM檢測的方法主要有間接免疫熒光法、酶聯免疫吸附法及金免疫滲濾法等。間接免疫熒光法有較高的靈敏度和特異性，被作為EB病毒診斷的“金標準”。但是該方法需要大量的專業技術知識，且細胞培養耗時多，需要用熒光顯微鏡這樣昂貴的儀器， 且受顯微鏡觀察的主觀影響較大，所以在實驗室使用中受到限制。酶免疫法的靈敏度和特異性稍低于間接免疫熒光法，有學者研究，通過增大抗IgM 抗體的包被量或可以提高檢測的靈敏度。但是由于單位微孔內蛋白的載量有限，這一措施較難實現。金免疫滲濾法是采用硝酸纖維素膜作為載體、膠體金作為示蹤物的一種檢測方法，具有高特異性和高靈敏度，但該方法操作步驟繁瑣，在臨床試用過程中易出現混亂。此外，以上三種方法均受類風濕因子陽性血清標本的影響，易造成假陽性或漏檢，需要預先通過超速離心或免疫吸附處理轉陰后檢測特異性IgM抗體，很難實現一次實驗完成檢測。而同樣使用膠體金作為示蹤物的膠體金免疫層析法未見相應的試劑，該方法操作簡便、快速、穩定性好，易于進行單份樣本檢測，且不需特殊儀器進行檢測；與滲濾法相比，不需要繁瑣的操作步驟，且由于示蹤物為固相易于保存、穩定性好。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服當前檢測EB病毒衣殼抗原IgM抗體技術在推廣使用中存在的缺陷，提供一種操作簡便、不需要特定儀器設備輔助、不需要對檢測人員進行特殊培訓的快速檢測試劑并且有效降低檢測成本，同時提供該試劑的制備方法。本專利技術為解決上述技術問題所采用的技術方案為一種EB病毒衣殼抗原IgM抗體膠體金法檢測試劑，該試劑包括金結合物墊(3)、硝酸纖維素反應膜(4)、樣品墊(2)、風濕因子處理墊(I)、吸水紙(5 )和PVC背襯(8 );將風濕因子處理墊、樣品墊、金結合物墊、硝酸纖維素反應膜和吸水紙粘附于PVC背襯上，風濕因子處理墊約為樣品墊長度的1/2并粘附于PVC背襯上，粘附位置以其中心位置與待粘附的樣品墊的中心位置重合為宜；樣品墊、金結合物墊、硝酸纖維素反應膜和吸水紙順次相互疊壓粘附于PVC背襯上；樣品墊覆蓋風濕因子處理墊粘附于PVC背襯上，并疊壓金結合物墊2-3mm，金結合物墊疊壓硝酸纖維素反應膜2-3_并與風濕因子處理墊間隔2-5_，吸水紙疊壓硝酸纖維素反應膜2-3_ ;金結合物墊上包被了抗人IgM單克隆抗體-膠體金的結合物，硝酸纖維素反應膜質控區(7)和檢測區(6)位置上分別包被了羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體和特異性的基因重組EB病毒衣殼抗原。所述的風濕因子處理墊是包被了風濕因子抗體的硝酸纖維素膜。所述檢測區包被的EB病毒衣殼抗原為純化的特異性基因重組抗原。該試劑的制備方法包括以下步驟 A :制備抗人IgM單克隆抗體取多份正常人血清，混合，經透析、離心、純化制得純度達95%的IgM抗體，以人IgM作為抗原，經脾內注射免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠，取小鼠的免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合，選擇性培養、篩選及克隆化獲得雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞接種于BALB/c小鼠腹腔制備腹水，以親和層析法提純鼠抗人IgM單克隆抗體； B :制備多克隆抗體以步驟A所制備的鼠抗人IgM單克隆抗體免疫山羊或兔，取血清純化后提取到羊抗小鼠IgG多克隆抗體或兔抗小鼠IgG多克隆抗體； C :制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原法制得粒徑20 40nm的膠體金顆粒； D :制備鼠抗人IgM單克隆抗體-膠體金結合物用0. IM碳酸鉀調節膠體金溶液pH值至最佳標記pH值,按照0. 010 0. 030 mg蛋白/mL膠體金的比例加入鼠抗人IgM單克隆抗體，混勻靜置，高速離心，棄上清，所得沉淀以十分之一初始膠體金體積的金結合物保存液溶解，制得鼠抗人IgM單克隆抗體-膠體金結合物；其中，金結合物保存液為含2 5%的牛血清白蛋白的pH值為8. 0 8. 2的0. 01 0. 02M Tris-HCl緩沖液，并含I 4%的蔗糖、0. 5% 1%的酪蛋白鈉、I 2%的Tween-20和萬分之五的疊氮鈉； E :制備風濕因子處理墊將抗風濕因子抗體以稀釋液稀釋至0. 5mg 2 mg/mL，均勻噴涂在硝酸纖維素膜上，充分干燥，其中，稀釋液為含I 2%海藻糖的pH值為7. 2 7. 6的0.02 0. 05M PBS溶液，并含I 2%的牛血清白蛋白； F :制備金結合物墊將步驟D所制備的鼠抗人IgM單克隆抗體-膠體金結合物均勻包被到玻璃纖維膜上，充分干燥； G :制備硝酸纖維素膜反應膜將羊抗小鼠IgG多克隆抗體或兔抗小鼠IgG多克隆抗體和重組EB衣殼抗原分別包被在硝酸纖維素膜的質控區和檢測區位置，充分干燥； H :將風濕因子處理墊、樣品墊、金結合物墊、硝酸纖維素反應膜和吸水紙粘附于PVC背襯上，風濕因子處理墊約為樣品墊長度的1/2并粘附于PVC背襯上，粘附位置以其中心位置與待粘附的樣品墊的中心位置重合為宜；樣品墊、金結合物墊、硝酸纖維素反應膜和吸水紙順次相互疊壓粘附于PVC背襯上；樣品墊覆蓋風濕因子處理墊粘附于PVC背襯上，并疊壓金結合物墊2-3_，金結合物墊疊壓硝酸纖維素反應膜2-3_并與風濕因子處理墊間隔2-5本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種EB病毒衣殼抗原IgM抗體膠體金法檢測試劑，其特征在于該試劑包括金結合物墊（3）、硝酸纖維素反應膜（4）、樣品墊（2）、風濕因子處理墊（1）、吸水紙（5）和PVC背襯（8）；將風濕因子處理墊、樣品墊、金結合物墊、硝酸纖維素反應膜和吸水紙粘附于PVC背襯上，風濕因子處理墊約為樣品墊長度的1/2并粘附于PVC背襯上，粘附位置以其中心位置與待粘附的樣品墊的中心位置重合為宜；樣品墊、金結合物墊、硝酸纖維素反應膜和吸水紙順次相互疊壓粘附于PVC背襯上；樣品墊覆蓋風濕因子處理墊粘附于PVC背襯上，并疊壓金結合物墊2?3mm，金結合物墊疊壓硝酸纖維素反應膜2?3mm并與風濕因子處理墊間隔2?5mm，吸水紙疊壓硝酸纖維素反應膜2?3mm；金結合物墊上包被了抗人IgM單克隆抗體?膠體金的結合物，硝酸纖維素反應膜質控區（7）和檢測區（6）位置上分別包被了羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體和特異性的基因重組EB病毒衣殼抗原。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：呂傳臣，羅威，張寧，姜欣，周逸，
申請(專利權)人：北京新興四寰生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：