本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于核酸適配體探針的一步法、非標(biāo)記型雙酚A快速、超靈敏、現(xiàn)場(chǎng)比色檢測(cè)方法。所述的檢測(cè)方法的步驟如下：（1）檢測(cè)體系最佳鹽濃度的確定；（2）金納米粒子與核酸適配體探針的結(jié)合，制備核酸適配體-金納米粒子復(fù)合物探針；（3）雙酚A的檢測(cè)。本發(fā)明專利技術(shù)可用于現(xiàn)場(chǎng)、快速、超靈敏檢測(cè)，無需其他輔助儀器設(shè)備。檢測(cè)工作可在10-15分鐘內(nèi)完成并得到定性和定量檢測(cè)結(jié)果；本發(fā)明專利技術(shù)只需將保護(hù)金納米粒子的核酸適配體探針的序列進(jìn)行改變和替換，即可實(shí)現(xiàn)其他目標(biāo)物的相應(yīng)檢測(cè)；本發(fā)明專利技術(shù)還具有特異性高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用范圍廣，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣常規(guī)應(yīng)用。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于食品安全、檢驗(yàn)檢疫、環(huán)境檢測(cè)
，具體涉及非標(biāo)記型雙酚A的非標(biāo)記型、一歩比色檢測(cè)法。
技術(shù)介紹
隨著社會(huì)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)全球化的進(jìn)ー步深入，不斷增長(zhǎng)的新興產(chǎn)品對(duì)檢驗(yàn)檢疫提出新的挑戰(zhàn)。依靠傳統(tǒng)儀器檢測(cè)雖然具有檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，但是大型儀器通常價(jià)格較為昂貴，并且需要具備相關(guān)知識(shí)的專業(yè)操作人員，同時(shí)存在檢測(cè)成本高昂等缺點(diǎn)，限制了大型儀器的大規(guī)模檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)?；诿庖叻治龅拿嘎?lián)免疫吸附法可以解決大型儀器的檢測(cè)成本高和不能夠用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的缺點(diǎn)，但由于酶聯(lián)免疫吸附法在檢測(cè)過程中需要多步的反復(fù)洗滌和分離的過程，以及需要具有一定專業(yè)知識(shí)的人進(jìn)行操作，一定程度上也限制了該方法的廣泛推廣使用?；诮鸺{米粒子核酸適配體探針的檢測(cè)方法的推廣和使用，將是應(yīng)對(duì)大規(guī)模樣品高通量、快速檢測(cè)的有效方法，且基于金納米粒子探針的相關(guān)檢測(cè)方法的使用不需要操作人員具有較深的專業(yè)知識(shí)背景即可使用，如用于早期懷孕診斷的早孕試紙條。金納米粒子探針已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種有害物質(zhì)的檢測(cè)并取得了豐碩的成果。如正在飛速發(fā)展的金標(biāo)試紙條檢測(cè)技術(shù)就具有檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，不需要大型儀器，使用肉眼即可判別等特點(diǎn)。本專利技術(shù)針對(duì)傳統(tǒng)大型儀器檢測(cè)方法不能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)、高通量、快速檢測(cè)的缺點(diǎn)，利用金納米粒子和核酸適配體制備金納米粒子核酸適配體復(fù)合物探針，用于食品包裝材料以及水資源污染中雙酚A的快速、現(xiàn)場(chǎng)、超靈敏檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)描述了使用一段可特異性識(shí)別雙酚A的單鏈核酸適配體探針與金納米粒子結(jié)合形成金納米粒子-核酸適配體復(fù)合探針，在有雙酚A存在的情況下，核酸適配體探針與雙酚A特異性結(jié)合，從而引起核酸適配體脫離金納米粒子表面，使得金納米粒子對(duì)鹽的耐受能力降低從而出現(xiàn)金納米粒子聚沉出現(xiàn)藍(lán)色的現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A的超靈敏快速檢測(cè)。本專利技術(shù)具體的技術(shù)方案如下 基于核酸適配體探針的一歩法非標(biāo)記型雙酚A (bisphenol A, BPA)的快速比色檢測(cè)法，以單鏈核酸適配體為雙酚A的識(shí)別探針，使用金納米粒子，在沒有單鏈核酸適配體探針保護(hù)的條件下會(huì)由于高鹽濃度引起金納米粒子的聚沉；當(dāng)所述金納米粒子上有可以特異性識(shí)別雙酚A的核酸適配體探針保護(hù)的條件下，不會(huì)被相同濃度的鹽溶液引起金納米粒子的聚沉；在有雙酚A核酸適配體探針保護(hù)的金納米粒子溶液中，加入不同濃度的雙酚A溶液后，雙酚A與能識(shí)別雙酚A的核酸適配體探針特異性結(jié)合，引起金納米粒子表面核酸適配體探針的脫落，從而重新引起金納米粒子的聚沉淀現(xiàn)象；不同濃度的雙酚A溶液引起金納米粒子聚沉的程度不同，根據(jù)金納米粒子聚沉引起其溶液變色程度的不同，實(shí)現(xiàn)雙酚A的快速、現(xiàn)場(chǎng)、ー步法檢測(cè)。基于核酸適配體探針的一歩法非標(biāo)記型雙酚A的快速比色檢測(cè)法的具體檢測(cè)操作步驟如下 (1)金納米粒子核酸適配體探針復(fù)合物的制備 將濃度為O. lg/L、粒徑為25 nm的金納米粒子溶液,在轉(zhuǎn)速10000 rpm/條件下,離心10分鐘，濃縮至原體積的1/4 ;分裝到6 10只離心管中，每管裝25μ ;在每管中分別加入ΙΟμ 濃度為O. 25Mfliol/L的特異性識(shí)別雙酚A的單鏈核酸適配體探針得到金納米粒子核酸適配體探針復(fù)合物溶液，室溫下孵育Ih ； 所述特異性識(shí)別雙酚A的單鏈核酸適配體探針的堿基序列為5’-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3’ ； (2)雙酚A的檢測(cè) 在裝有金納米粒子核酸適配體探針復(fù)合物溶液的7只離心管中分別加入濃度為20、30、40、50、60、70、80mmol/L的雙酚A溶液，另ー只裝有金納米粒子核酸適配體探針復(fù)合物溶液的離心管中不加入雙酚A溶液作為空白對(duì)照管，孵育IOmin ;在上述8只離心管中再分別加入適量濃度的氯化鈉溶液，一方面通過肉眼觀察8只離心管中溶液的聚沉情況和顏色變化，通過與空白對(duì)照管的比較，如顏色發(fā)生明顯的區(qū)別于空白對(duì)照管的藍(lán)色，說明含有雙酚A，從而實(shí)現(xiàn)雙酚A (BPA)的快速、定性檢測(cè)； 另ー方面用紫外-可見風(fēng)光光度計(jì)測(cè)定上述8只離心管中溶液在190 SOOnm處的紫外-可見吸收光譜，建立紫外吸收峰強(qiáng)度與目標(biāo)雙酚A濃度之間的線性關(guān)系，確定雙酚A快速檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)雙酹A的超靈敏定量檢測(cè)。本專利技術(shù)的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面 1、本專利技術(shù)利用可特異性識(shí)別雙酚A的核酸適配體探針與金納米粒子非特異性結(jié)合，得到核酸適配體-金納米粒子復(fù)合物探針，保護(hù)金納米粒子溶液耐受一定濃度的鹽溶液而不發(fā)生聚沉現(xiàn)象。而在雙酚A存在的條件下，核酸適配體探針與雙酚A特異性結(jié)合，引起雙酚A核酸適配體從金納米粒子表面脫落，使得金納米粒子失去耐鹽能力而聚集，從而建立了雙酚A的一歩法、非標(biāo)記型快速、超靈敏、現(xiàn)場(chǎng)比色檢測(cè)法，通過肉眼觀察金納米粒子溶液的顏色變化，定性分析檢測(cè)體系中是否存在目標(biāo)檢測(cè)物雙酚A ;通過建立反應(yīng)后金納米粒子溶液的紫外-可見吸光光度值，建立吸光光度值與雙酚A濃度之間的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目標(biāo)物雙酚A的濃度，整個(gè)檢測(cè)工作可在10分鐘內(nèi)完成并得到檢測(cè)結(jié)果； 2、本專利技術(shù)為通用型檢測(cè)方法，只需要將與金納米粒子非特異性結(jié)合的核酸適配體探針的序列進(jìn)行相應(yīng)的改變和替換，即可實(shí)現(xiàn)其他目標(biāo)物的快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)； 3、本專利技術(shù)還具有特異性高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用范圍廣，成本低廉，操作使用方法簡(jiǎn)單易于推廣應(yīng)用?？蓱?yīng)用于醫(yī)院、家庭、以及食品安全與檢驗(yàn)檢疫的海關(guān)、機(jī)場(chǎng)、ロ岸等需要現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)機(jī)構(gòu)。附圖說明圖1為ー步法非標(biāo)記型雙酚A檢測(cè)結(jié)果。圖2為ー步法非標(biāo)記型雙酚A檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)ー步地描述。所用原料核酸適配體探針為上海生物工程有限公司合成，BPA標(biāo)準(zhǔn)品為美國(guó)Sigma公司訂購(gòu),金納米粒子溶液為實(shí)驗(yàn)室合成。實(shí)施例I 基于核酸適配體探針的一歩法非標(biāo)記型雙酚A (bisphenol A, BPA)的快速比色檢測(cè)法的具體操作步驟如下 (I)檢測(cè)體系最佳鹽濃度的選擇 取濃度為O. lg/L、粒徑為25 nm的金納米粒子溶液,轉(zhuǎn)速10000 rpm/條件下,離心10 分鐘，濃縮至原體積的1/4，分裝至A、B兩組離心管中，每組8只管，每管裝25μ ，得到A組濃縮的金納米粒子溶液和B組濃縮的金納米粒子溶液； 將IOPL濃度為O. 25Mfliol/L的特異性識(shí)別雙酚A的單鏈核酸適配體探針分別加入上述B組濃縮的金納米粒子溶液中，孵育lh，得到加入核酸適配體探針的B組濃縮的金納米粒子溶液； 所述特異性識(shí)別雙酚A的單鏈核酸適配體探針的氨基酸序列為5’-CCG GTG GGT GGTCAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3’ ； 在A組濃縮的金納米粒子溶液和加入核酸適配體探針的B組濃縮的金納米粒子溶液中分別加入25PL不同濃度的氯化鈉溶液，得到A組膠體金溶液和B組膠體金溶液，并使得A組膠體金溶液的最終的鹽濃度和B組膠體金溶液的最終的氯化鈉濃度分別為10、20、30、40、50、60、70、80mmol/L。根據(jù)A組膠體金溶液和B組膠體金溶液的聚沉情況，選擇能本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
基于核酸適配體探針的一步法非標(biāo)記型雙酚A（bisphenol?A,?BPA）的快速比色檢測(cè)法，其特征在于：以單鏈核酸適配體為雙酚A的識(shí)別探針，使用金納米粒子，在沒有單鏈核酸適配體探針保護(hù)的條件下會(huì)由于高鹽濃度引起金納米粒子的聚沉；當(dāng)所述金納米粒子上有可以特異性識(shí)別雙酚A的核酸適配體探針保護(hù)的條件下，不會(huì)被相同濃度的鹽溶液引起金納米粒子的聚沉；在有雙酚A核酸適配體探針保護(hù)的金納米粒子溶液中，加入不同濃度的雙酚A溶液后，雙酚A與能識(shí)別雙酚A的核酸適配體探針特異性結(jié)合，引起金納米粒子表面核酸適配體探針的脫落，從而重新引起金納米粒子的聚沉淀現(xiàn)象；不同濃度的雙酚A溶液引起金納米粒子聚沉的程度不同，根據(jù)金納米粒子聚沉引起其溶液變色程度的不同，實(shí)現(xiàn)雙酚A的快速、現(xiàn)場(chǎng)、一步法檢測(cè)。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳偉，梅占龍，薛峰，吳晶晶，蔣原，鄭磊，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：合肥工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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