一種質粒DNA定量檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術首次提供了一種質粒DNA定量檢測試劑盒，具有采用高準確度的超聲波-同位素稀釋質譜法準確定量的質粒DNA標準品，彌補了現有試劑盒不能對質粒DNA進行定量的缺點。本發明專利技術還提供了一種質粒DNA定量檢測方法，分別測定不同濃度的質粒DNA標準品的熒光信號強度，繪制濃度—熒光信號強度標準曲線；然后測定待測質粒DNA樣品熒光信號強度，根據所繪制標準曲線可準確計算出待測樣品的DNA濃度。本方法和試劑盒首次采用標準質粒作為熒光染料法中的DNA標準進行定量，靈敏度高，可檢測低至1pg的DNA；線性范圍廣，可檢測0.25ng/mL~1000ng/mL的質粒DNA；對標準質粒采用超聲波-同位素稀釋質譜方法定量，得到的量值不確定度低，準確度高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生化分析領域，具體涉及一種質粒DNA熒光染料定量檢測方法和檢測試劑盒。
技術介紹
質粒DNA是游離于染色體外的小型(l_200kb)的共價、閉合、環狀的雙鏈DNA分子，能自主復制并能穩定遺傳的遺傳因子。它通常編碼一些酶基因，如產生抗生素、抗生素抗性、限制酶、修飾酶等有利于宿主的酶基因。由于它分子小、能夠自主復制并且穩定遺傳，因此是分子生物學、基因工程技術中常用的載體。在分子生物學領域進行DNA分析時常常需要對質粒DNA進行準確定量，如進行克隆文庫構建時的酶切和連接操作，以及對質粒DNA進行測序時，為了得到良好的后續實驗結果，都需要對質粒DNA的濃度進行準確測定。因此對質粒DNA定量有著廣泛的應用。 采用Pic0Green熒光染料法對核酸進行定量，因其方法的靈敏度高、線性范圍廣，因此應用非常廣。然而，PicoGreen熒光染料法在對DNA進行定量時的局限性表現為，第一，方法的準確度高低取決于試劑盒中DNA標準品含量的準確度，而目前市售的試劑盒中DNA標準品的含量值均為廠家提供的一個參考值，S卩？ ng/ml，這個值一般是通過紫外吸收(0D260)確定的，該值也沒有相關的不確定度信息和溯源性。第二，由于PicoGreen對不同分子大小的DNA結合效率會有差異，如果依據定量的DNA標準和所測定的DNA樣本分子大小差異很大時，會導致對樣本定量結果的偏差很大，而目前商業化的試劑盒中均只有一個分子大小的DNA標準，即Lambda噬菌體DNA標準(48. 5K)。有報道稱以Lambda為標準，如果對分子量<23kb的DNA進行定量，測定結果會比真實結果偏低。因此，如果對質粒DNA采用PicoGreen法定量，由于質粒DNA標準品的缺乏,現有的商業化的試劑盒還無法滿足要求。因為PicoGreen熒光染料法對質粒DNA定量需要具有準確量值的質粒DNA標準物質，而目前并沒有含有準確量值的質粒DNA標準可用作PicoGreen法定量質粒的標準。由于該量值直接關系到試劑盒定量方法的準確度高低，因此要研制質粒DNA標準品，必須選擇準確度高，溯源途徑清晰的DNA絕對定量方法。對質粒DNA進行絕對定量的方法有基于單分子擴增的數字PCR方法、有依賴于磷元素標準的電感耦合等立體發射光譜法。我們建立了一種基于核苷酸標準品的超聲波-同位素質譜法，可對質粒DNA進行絕對定量，從而為PicoGreen熒光染料法提供DNA標準。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種質粒DNA熒光染料定量檢測方法和檢測試劑盒，該方法靈敏度高，線性范圍廣，準確度高，精密度好。本專利技術首次建立了質粒DNA熒光染料法定量檢測方法，采用質粒DNA標準，利用PicoGreen法對質粒DNA進行準確定量,本專利技術人進行了如下研究工作I、質粒DNA濃度與熒光信號強度是否存在線性關系(見實施例I)將構建的5k大小的質粒稀釋成不同濃度的DNA樣品，稀釋后的質粒DNA與PicoGreen突光染料結合后,測定突光信號。結果發現質粒DNA濃度與熒光信號成正比，線性相關系數為O. 99。因此可以以熒光信號強度測算質粒DNA濃度。本研究為確定本方法的可行性打下了基礎。2、不同分子量大小的DNA與熒光信號強度的線性關系差別(見實施例3)選擇了分子大小分別為5k，9k，48k的質粒/基因組分子作為研究對象，分別將DNA進行梯度稀釋，稀釋后的DNA與PicoGreen熒光染料結合后，測定熒光信號。 結果發現4種不同分子量的DNA，濃度與熒光信號均成正比，且線性相關性都很好，相關系數均>0. 99。但不同分子量大小的DNA與熒光信號的線性關系(斜率)不同，分子量越大，直線的斜率越大。以商業化試劑盒lambda DNA作為標準(48k)測定2k IOk的質粒DNA,結果偏差較大，具體見表2。此研究結果表明，測定質粒DNA濃度應選擇分子量差別不大的質粒DNA標準品。3、研究了對質粒DNA定量的線性范圍(見實施例2)將質粒DNA稀釋至O. Olng/mL^lOOOOng/mL,與熒光染料結合后，測定熒光信號值，結果發現DNA濃度在O. 25ng/mL 1000ng/mL之間時，熒光強度與DNA濃度成正比。此研究確定了熒光染料法定量檢測DNA的濃度范圍是O. 25ng/mL 1000ng/mL。3、研究了對質粒DNA的檢測靈敏度(見實施例2)由于最低檢測到的熒光信號對應的DNA濃度為O. 01ng/mL，加樣量100 μ L，因此計算出該方法的靈敏度為lpg。4、定量限(見實施例2)根據最低定量的線性范圍，定量限為25pg。根據上述實驗結果，本專利技術提供了一種質粒DNA熒光染料法定量檢測方法，其特征為用不同濃度的質粒DNA標準品與Pi coGreen熒光染料混合，分別測定熒光信號強度，繪制濃度一熒光信號強度標準曲線；然后將待測質粒DNA樣品稀釋至0. 25ng/mL^lOOOng/mL,與熒光染料混合后，測定熒光信號強度；根據所繪制標準曲線計算待測質粒DNA樣品的DNA濃度。待測質粒DNA的分子大小為2k 10k。具體操作步驟如下I)配制合適濃度的熒光染料用工作液稀釋PicoGreen熒光染料至O. 6^1. O μ M濃度；2)制備不同濃度的標準品檢測液用工作液對標準品進行梯度稀釋，得到4 8個濃度的稀釋液；如濃度為Ing/ μ L、0. 5ng/ μ L、0. 25ng/ μ L、0. lng/ μ L、0. Olng/ μ L ；取每一種濃度的標準品稀釋液100 μ L分別與100 μ L步驟I)得到的熒光染料混勻；3)制備待測物檢測稀釋液A將待測質粒DNA樣品用紫外法測定大致濃度范圍后，用工作液稀釋至濃度為O.25ng/mL^1000ng/mL ；B取稀釋好的樣品100 μ L與100 μ L步驟I)得到的熒光染料混勻；4)測定不同濃度標準品的熒光信號，繪制濃度一熒光信號強度曲線A將上述不同濃度的標準品檢測稀釋液轉移至同一個96孔酶標板上，利用酶標儀分別讀取每種濃度標準品的熒光信號強度；設置酶標儀激發波長480nm，吸收波長為520nm ；B以標準品每種DNA濃度為橫坐標，以相應的突光信號值為縱坐標繪制“突光信號值-DNA濃度”標準曲線；5)測定待測物熒光信號方法同步驟4) A ;6)計算待測樣品濃度將待測樣品熒光信號值代入步驟4) B得到的標準曲線，得出待測樣品的濃度。以上方法中，所述工作液的成分是IOmM Tris-HCl，含ImM EDTA, pH=8. O。本專利技術用超聲波一同位素稀釋質譜方法驗證了本方法的準確度(見實施例3)。本方法的創新點是I、首次采用標準質粒作為熒光染料法中的DNA標準對質粒樣品進行定量；2、靈敏度高可檢測低至Ipg的DNA ；3、方法線性范圍廣可檢測O. 25ng/mL 1000ng/mL的DNA，跨越4個數量級；4、準確度高首次采用高準確度的超聲波-同位素稀釋質譜法對標準質粒進行定量，得到的量值不確定度低，準確度高。本專利技術還提供了一種質粒DNA熒光染料定量檢測試劑盒，試劑盒中包括質粒DNA標準品，PicoGreen熒光染料和工作液，其特征為工作液成分為IOmM Tris-HCl，含 ImM EDTA, ρΗ=8· O ；質粒DNA標準品為本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種質粒DNA定量檢測試劑盒，試劑盒中具有標準品、工作液和染料，其特征為：1）所述標準品為具有準確DNA濃度定量值的環狀質粒分子DNA，濃度范圍是1ng/μL～300ng/μL；2）所述工作液成分為10mM?Tris?HCl，含1mM?EDTA，pH=8.0；3）所述染料是PicoGreen熒光染料。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：董蓮華，孟盈，王晶，傅博強，高運華，張玲，
申請(專利權)人：中國計量科學研究院，
類型：發明
國別省市：