一種植酸酶的檢測方法技術

本發明專利技術屬于生物檢測領域，涉及一種用于檢測樣品中植酸酶的方法。主要是利用羧基-氨基化學偶聯法偶聯分散型納米微球和植酸分子，在溶劑相中形成植酸酶與植酸結合的表面快速反應體系，產物正磷酸直接進入溶劑相，而未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球。通過低溫和高速離心去除微球，在酸性條件下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定。該方法在實現植酸酶活力快速測定的同時，使未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球，避免了常規方法中未完全反應的植酸分子與顯色劑反應所造成的背景值干擾，使得痕量測定成為可能。適用于特定環境樣品如土壤、水體和根際殘留物中的痕量植酸酶樣品測定。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物檢測領域，涉及一種用于檢測樣品中植酸酶的方法。
技術介紹
植酸酶廣泛存在于植物、動物組織和微生物中。植酸酶分為3類肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶和非特性的正磷酸鹽單酯磷酸水解酶。目前發現的植酸酶有3種來源一是存在于植物中的天然植酸酶，如小麥、大麥、黑麥等谷物籽粒及其加工副產物中含有的天然植酸酶；二是微生物來源的植酸酶，也是目前認為最有潛力的植酸酶；三是從牛瘤胃中分離出的一種可以產生植酸酶的細菌，同時還可以產生有營養功能的其他酶類。植酸酶能催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)，具有特殊的空間結構，能夠依次分離植酸分子中的磷，將植酸(鹽)降解為肌醇和無機磷，同時釋放出與植酸(鹽)結合的其它營養物質。由于植酸酶能夠分解飼料的植酸為肌醇和無機磷，提高飼料中磷的利用率，減少無機磷的用量；降低植酸及其植酸鹽對蛋白質、礦質元素的螯合作用，提高飼料中礦質元素和營養物質的利用率，并減少植酸對動物腸胃內相關消化酶的活性的抑制作用，最終提高動物的生產性能，降低磷對環境的污染作用。因此植酸酶制劑廣泛應用于飼料工業，同時在食品工業、環境保護等領域亦發揮積極作用。在植酸酶活性測定中，一般利用植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解植酸鈉形成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性環境中與底物反應生成藍色絡合物，通過比色測定和標準曲線，最終換算成植酸酶活力單位。然而，該方法的主要問題是未完全反應的底物亦與顯色劑反應，造成背景值干擾，從而影響到植酸酶活力的精確定量，對于特定環境樣品如土壤、水體和根際殘留物中的痕量植酸酶測定并非合適。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服上述缺點，通過納米微球的快速反應和離心去除，排除背景值的干擾，從而提供一種樣品中植酸酶的檢測方法?！N植酸酶的檢測方法，示意圖見圖4，利用羧基-氨基化學偶聯法偶聯分散型納米微球和植酸分子，在溶劑相中形成植酸酶與植酸結合的表面快速反應體系，產物正磷酸直接進入溶劑相，而未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球，通過低溫和高速離心去除微球，在酸性條件下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定，通過制定的標準曲線，最終換算成植酸酶活力單位。所述的分散型納米微球為單分散羧基化聚苯乙烯微球，粒徑<50nm，表面載基團為羧基。所述的利用羧基-氨基化學偶聯法偶聯分散型納米微球和植酸分子是將單分散羧基化聚苯乙烯微球用碳化二亞胺活化2(T40min,然后加入N-輕基硫代琥拍酰亞胺15min使微球形成穩定的活潑酯中間體，再加入植酸鈉30°C溫育1-2小時，洗滌后收集偶聯植酸分子的納米微球；其中所述的單分散羧基化聚苯乙烯微球、碳化二亞胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺以及植酸鈉的用量為Ig :0. 01 O.1mol O. 005 O.1mol O. 001 O. Olmol ;優選Ig O. 05mol :0. Olmol : O. 002mol。本專利技術植酸酶的檢測方法中，納米微球和植酸分子偶聯后，在37° C、PH4. 5^5. 5 條件下加入植酸酶樣品進行反應，未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球；通過4°C低溫和高速離心2(T30min去除微球，于酸性條件(即pH4. 5^5. 5)下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定。本專利技術植酸酶的檢測方法中，采用植酸酶純蛋白為標準樣品，測定標準曲線，然后再根據樣品比色值結果測算實際植酸酶含量。根據權利要求1或4所述的植酸酶的檢測方法，所述的高速離心為15，OOOXgo所述的植酸酶I個酶活力單位(U)定義為在37° C、pH4. 5飛.5條件下，每分鐘從 5mM的植酸鈉溶液中釋放出Ιμπιο 的無機磷所需要的酶量定義為。本專利技術的有益效果在于，通過納米微球的高效表面反應體系可以實現植酸酶活力的快速測定；同時，未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球，避免了常規方法中未完全反應的植酸分子與顯色劑反應所造成的背景值干擾，使得痕量測定成為可能。適用于特定環境樣品如土壤、水體和根際殘留物中的痕量植酸酶樣品測定。附圖說明圖1是羧基化聚苯乙烯分子式(A)和羧基化聚苯乙烯微球掃描電鏡(B)圖圖2是活化劑EDC (碳化二亞胺)分子式(A)和保護劑Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)分子式圖 圖3是植酸酶測定標準曲線圖4是納米微球和植酸分子偶聯、催化反應和比色測定示意圖具體實施方式實施例I如圖1所示，納米微球為單分散羧基化聚苯乙烯微球，粒徑<50nm，表面載基團為羧基。微球和植酸分子偶聯過程采用的是羧基-氨基化學偶聯法，包括將單分散羧基化聚苯乙烯微球5mg用5ml50mM活化劑EDC(碳化二亞胺)(圖2A)活化30min，然后加入lml50mM 保護劑Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)(圖2B)15min使微球形成穩定的活潑酯中間體，再加入2ml5mM植酸鈉30°C溫育1_2小時，洗滌后收集偶聯植酸分子的納米微球。實施例2如表I所示，將偶聯植酸分子的納米微球用O.1M乙酸緩沖液配制成2. 5%(w/v%, 重量/體積百分比，具體指g/100ml)的懸浮液，調整pH5.0。取80 μ I微球，加入樣品或植酸酶標準品20 μ I。以植酸酶純蛋白為標準品，設立8個濃度梯度(2U/ml，lU/ml,0. 5U/ ml,O. 25U/ml，0. 125U/ml，0. 0625U/ml，0. 03125U/ml 和 OU/ml)。在 37°C預熱 5min 后，混勻 5min,于37°C保溫30min。在4°C、15, 000 X g條件下離心20min,收集上清。接著,依次加入 5%(w/v%,具體指g/100ml)三氯乙酸100 μ I (終止液)和顯色劑100 μ I (1. 5%(w/v%,具體指g/100ml)鑰酸鈉和2. 7%(w/v%,具體指g/100ml)硫酸亞鐵按4:1的比例,現配現用),混勻后立即在波長700nm比色測定。酶活力單位定義在37° C、pH5. O條件下，每分鐘從5mM 的植酸鈉溶液中釋放出Iymol的無機磷定義為I個酶活力單位(U)。如圖3所示，根據植酸酶標準品測定的標準曲線，相關系數R2=O. 993，測定的最低濃度0.03125U/ml。對植酸酶樣品1_4的吸光度值進行換算后，獲得樣品的植酸酶實測結果，如表2所示。表I權利要求1.，其特征是利用羧基-氨基化學偶聯法偶聯分散型納米微球和植酸分子，在溶劑相中形成植酸酶與植酸結合的表面快速反應體系，產物正磷酸直接進入溶劑相，而未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球，通過低溫和高速離心去除微球，在酸性條件下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定，通過制定的標準曲線，最終換算成植酸酶活力單位。2.根據權利要求I所述的植酸酶的檢測方法，其特征是所述的分散型納米微球為單分散羧基化聚苯乙烯微球，粒徑<50nm，表面載基團為羧基。3.根據權利要求2所述的植酸酶的檢測方法，其特征是所述的利用羧基-氨基化學偶聯法偶聯分散型納米微球和植酸分子是將單分散羧基化聚苯乙烯微球用碳化二亞胺活化2(T40min，然后加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺反應15min使微球形成穩定的活潑酯中間體，再加入植酸鈉30°C溫本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種植酸酶的檢測方法，其特征是利用羧基?氨基化學偶聯法偶聯分散型納米微球和植酸分子，在溶劑相中形成植酸酶與植酸結合的表面快速反應體系，產物正磷酸直接進入溶劑相，而未反應的肌醇衍生物仍滯留于固相微球，通過低溫和高速離心去除微球，在酸性條件下在溶劑相中加入顯色劑生成藍色復合物，在波長700nm比色測定，通過制定的標準曲線，最終換算成植酸酶活力單位。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳法軍，潘衛東，萬貴鈞，趙宗潮，郭維維，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：