一種用4-硝基-1-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)制備β-半乳糖苷酶顯色底物的方法及其應(yīng)用技術(shù)

一種用4-硝基-1-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)制備β-半乳糖苷酶顯色底物的方法及其應(yīng)用；先將β-D-吡喃半乳糖所有羥基用包括但不限于甲酸和乙酸的短鏈羧酸生成酯，再與HBr的甲酸或乙酸溶液反應(yīng)得α-溴代半乳糖多羧酸酯，進(jìn)一步在堿性條件下與4-硝基-1-萘酚或其衍生物在丙酮中反應(yīng)得糖苷酯，在甲醇或乙醇中脫酰化得4-硝基-1-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷或4-硝基-1-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷即為顯色底物；此類顯色底物經(jīng)β-半乳糖苷酶作用釋放4-硝基-1-萘酚或其衍生物為顯色產(chǎn)物，適于在較寬pH范圍內(nèi)測定顯色產(chǎn)物吸收跟蹤反應(yīng)過程確定β-D-半乳糖苷酶活性。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及β -半乳糖苷酶新型顯色底物合成方法及在測定β -半乳糖苷酶活性中的應(yīng)用，包括但不限于檢測β-D-半乳糖苷酶活性和基于檢測β-半乳糖苷酶活性的免疫分析；此類新型顯色底物用于中性或偏酸性連續(xù)跟蹤β-半乳糖苷酶反應(yīng)過程，在測定顯色產(chǎn)物吸收靈敏度方面明顯優(yōu)于用4-硝基苯酚類顯色團(tuán)制備的顯色底物。
技術(shù)介紹
光度法測定β -半乳糖苷酶活性主要有終點(diǎn)法和連續(xù)跟蹤過程法；在自動(dòng)化分析領(lǐng)域，連續(xù)跟蹤酶反應(yīng)過程測定酶活性有明顯優(yōu)勢；適合連續(xù)跟蹤β_半乳糖苷酶反應(yīng)過程的顯色底物包含對-硝基苯基-β-D-半乳糖苷[Biochemical Zeitschrift, 1960, 333 :209]、4-甲基扇形酮基-β-D-半乳糖苷[J Organ Chem，1962，27 :1074]、氯酚紅基-β -D-半乳糖苷等。這些顯色底物在pH < 7時(shí)對應(yīng)顯色產(chǎn)物消光系數(shù)都很低，都不適合在pH < 7的緩沖液中連續(xù)跟蹤β -半乳糖苷酶反應(yīng)過程；而4-硝基-I-萘酚在ρΗ5. 5 以上消光系數(shù)都很高(圖I)，顯著高于4-硝基苯酚(ρΝΡ)和鄰硝基苯酚(oNP)，用于合成這類顯色底物在測定顯色產(chǎn)物靈敏度上更有優(yōu)勢。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)用4-硝基-I-萘酚類顯色團(tuán)制備β -半乳糖苷酶的新型顯色底物；這些顯色底物被酶水解釋放的顯色產(chǎn)物吸收峰在460nm附近，且在pH5. 5到pH7. O之間的摩爾消光系數(shù)比4-硝基苯酚高I倍以上，在偏酸性的條件下連續(xù)跟蹤β -半乳糖苷酶的反應(yīng)過程具有明確優(yōu)勢，便于高靈敏度自動(dòng)化分析；在PH > 7. O以上緩沖液中，此類新型顯色底物所得顯色產(chǎn)物的摩爾消光系數(shù)也顯著高于4-硝基苯酚。4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷也有合成方法報(bào)道,如文獻(xiàn)[Tetrehedron Letter, 2007,48(6) :993-996]、 [Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(4) 1405-1410]、[CarbonhydrateResearch,2009, 344(4) :511-515]、[Carbonhydrate Research, 2009, 344 (16) :2245-2249]所述；主要有三種方法合成β _D_半乳糖苷方法I : β -D-吡喃半乳糖在堿催化或酸催化下與短鏈酰化劑在有或無溶劑條件下反應(yīng)制得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯為中間體I沖間體I與HBr乙酸溶液反應(yīng)生成 α -溴代-D-吡喃半乳糖四乙酸酯為中間體2 ；中間體2與酚類顯色團(tuán)在碳酸鉀的丙酮溶混懸液中反應(yīng)生成酚類對應(yīng)的β -D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯為中間體3 ;此中間體3在堿催化下甲醇溶液中脫乙酰基得目標(biāo)顯色底物β-D-吡喃半乳糖苷；所用酰化劑主要是乙酰氯或乙酸酐、甲酰氯或甲酸酐。方法2 :上述中間體2與4-硝基-I-萘酚或其衍生物在相轉(zhuǎn)移催化劑如四丁基溴化胺(TBAB)和無機(jī)堿包括但不限于氫氧化鈉作用下反應(yīng)制得新型β-D-半乳糖苷類顯色底物。方法3 :中間體I在三氟化硼-乙醚及三丁基氧化錫催化下，在苯中與4-硝基-I-萘酚直接反應(yīng)得到半乳糖苷酶的新型β-D-半乳糖苷類顯色底物。4-硝基-I-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)的β -半乳糖苷酶顯色底物至今未見報(bào)道； 理論上可用類似于4-硝基苯酚反應(yīng)制備，故有上述方法I、方法2和方法3應(yīng)都適用。本專利技術(shù)所述β -半乳糖苷酶的新型顯色底物合成方法及應(yīng)用包括如下內(nèi)容a本專利技術(shù)所涉及4-硝基-I-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)的β -半乳糖苷酶顯色底物為β -D-吡喃半乳糖苷，具有如下的結(jié)構(gòu)通式本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用4?硝基?1?萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)制備β?半乳糖苷酶顯色底物的方法及其應(yīng)用；具體涉及將β?D?吡喃半乳糖羥基全部酰化成酯并進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成α?溴代半乳糖酯，再用4?硝基?1?萘酚或其衍生物類顯色團(tuán)取代溴得到β?D?吡喃半乳糖苷酯，將這類糖苷酯脫去酰基得β?D?吡喃半乳糖苷作為β?半乳糖苷酶的顯色底物；這類顯色底物在β?半乳糖苷酶作用釋放4?硝基?1?萘酚或其衍生物為顯色產(chǎn)物，用于通過測定顯色產(chǎn)物吸收確定β?半乳糖苷酶活性。

【技術(shù)特征摘要】
1.ー種用4-硝基-I-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)制備β -半乳糖苷酶顯色底物的方法及其應(yīng)用；具體涉及將β-D-吡喃半乳糖羥基全部酰化成酯并進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成α-溴代半乳糖酷，再用4-硝基-I-萘酚或其衍生物類顯色團(tuán)取代溴得到β -D-吡喃半乳糖苷酷，將這類糖苷酯脫去酰基得β -D-吡喃半乳糖苷作為β -半乳糖苷酶的顯色底物；這類顯色底物在β -半乳糖苷酶作用釋放4-硝基-I-萘酚或其衍生物為顯色產(chǎn)物，用于通過測定顯色產(chǎn)物吸收確定半乳糖苷酶活性。2.據(jù)權(quán)利要求I，ー種用4-硝基-I-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)制備β-半乳糖苷酶顯色底物的方法及其應(yīng)用，所述β-D-吡喃半乳糖苷類顯色底物結(jié)構(gòu)如下3.據(jù)權(quán)利要求I，ー種用4-硝基-I-萘酚或其衍生物為顯色團(tuán)制備β-半乳糖苷酶顯色底物的方法及其應(yīng)用，β-半乳糖苷酶的這類顯色底物合成過程涉及如下步驟 (一)β -D-吡喃半乳糖在堿或酸催化下，用包括但不限于甲酸或こ酸短鏈羧酸對應(yīng)的酰化劑在有或無溶劑條件下反應(yīng)得β-D-吡喃半乳糖五羧酸酯為中間體I ;所用堿催化劑包括但不限于碳酸和醋酸的無水鈉鹽和鉀鹽、吡啶和三こ胺；所用酸催化劑包括但不限于磷酸、硫酸、對甲苯磺酸；所用酰化劑包括但不限于甲酸酐、甲酰氯、こ酸酐及こ酰氯；所用溶劑包括但不限于丙酮或四氫呋喃或二者混合物； (ニ)以甲酸或こ酸為溶劑吸收氣體HBr制成對應(yīng)溶液，再加入中間體I反應(yīng)生成α -溴代-D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯為中間體2 ； (三)在無機(jī)堿和丙酮或ニ甲基甲酰胺或水及其混合物中，上述中間體2與4-硝基-I-萘酚或其衍生物以混懸液狀態(tài)反應(yīng)生成4-硝基-I-萘-β -D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯為中間體3或4-硝基-I-萘酚衍生物的β -D-吡喃半乳糖苷四羧酸酯為中間體3 ;所用無機(jī)堿包括但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀和碳酸鈉碳；相轉(zhuǎn)移催化劑也適用于此步反應(yīng)制備所述中間體3，這類相轉(zhuǎn)移催化劑包括但不限于四丁基溴化銨、四芐基溴化銨； (四)中間體3在堿催化下，在甲醇或こ醇或水中脫酰基得4-硝基-I-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷或4-硝基-I-萘酚衍生物的β-D-吡喃半乳糖苷，即為β-半乳糖苷酶的新型顯色底物；所用堿催化劑包括但不限于甲醇鈉、甲醇鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀。4.據(jù)權(quán)利要...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：廖飛，楊曉蘭，黨紀(jì)政，劉紅博，張奕，李元麗，
申請(專利權(quán))人：重慶醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：