本發明專利技術涉及小麥的一個抗旱相關基因TaPK及其編碼蛋白，同時涉及TaPK基因在提高小麥抗旱能力中的應用。本發明專利技術小麥抗旱基因TaPK具有序列表中SEQ?ID?No.1的核苷酸序列。該基因的編碼蛋白是下述氨基酸序列之一：(1)序列表中的SEQ?ID?No.2序列；(2)將序列表中的SEQ?ID?No.2氨基酸殘基序列經過取代、缺失和/或添加一至多個氨基酸殘基且具有同等抗旱活性由(1)衍生的蛋白質。本發明專利技術的基因能夠有效提高植物對干旱脅迫的抗性，將在培育抗旱性增強的植物中發揮重要的作用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物基因工程
，具體涉及小麥抗旱相關基因TaPK及其編碼蛋白與應用，特別涉及該基因及其編碼蛋白與其在培育抗旱性提高植物中的應用。
技術介紹
干旱是影響植物生長和農作物 產量的最主要的環境因子，是制約農業生產和發展的全球性問題，干旱不僅嚴重影響植物生長發育，造成作物減產，而且是生態環境日益干旱。隨著對植物抗旱的基礎分子生物學研究的不斷深入和對抗性基因的不斷發現和挖掘，利用轉基因手段分離克隆抗旱基因，培育抗旱新品種來獲得抗干旱的轉基因植物，已經成為當今植物生物
研究的熱點之一。目前利用基因工程技術開展植物抗旱方面的研究已取得了較大進展。研究表明，將植物本身以及其它生物中抗旱相關基因轉入植物中，其異源轉錄和翻譯產物可以使植物的抗旱能力提高。本實驗室以新疆春小麥主栽品種新春6號(典型既抗旱又具備高水分利用效率的品種)為實驗材料，利用cDNA-AFLP技術分析該品種在兩葉一心水分脅迫下基因表達的差異，獲得一些可能與小麥抗旱和水分高效利用相關的基因表達序列標簽。通過測序及序列分析，發現其中一個上調序列與丙酮酸激酶基因具有很高的同源性，預測丙酮酸激酶基因在小麥抗旱過程中可能發揮一定的作用。小麥是我國最重要的糧食作物之一，但我國小麥的主產區受到干旱和鹽脅迫較為嚴重，小麥產量不同程度的受到了影響，因此，開展小麥抗旱相關基因的篩選克隆和功能研究，培育抗旱小麥新品種是非常必要的，也是非常迫切的研究課題。
技術實現思路
本專利技術根據小麥干旱脅迫下cDNA-AFLP表達譜的數據選出在小麥葉片在水分脅迫下誘導表達的TaPK基因，然后根據序列設計特異性引物，從小麥葉片cDNA文庫中克隆得到其全長cDNA，并在煙草中進行功能驗證。本專利技術提供了一種小麥抗旱基因TaPK及其編碼蛋白與應用。本專利技術的小麥抗旱基因，名稱為TaPK，其cDNA是序列表中SEQ ID No. I的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID No. I由1542個堿基組成。以上所說的小麥抗旱基因TaPK的編碼蛋白，是下述氨基酸序列之一 (1)序列表中的SEQID No. 2序列； (2)將序列表中的SEQIDNo. 2氨基酸殘基序列經過取代、缺失和/或添加一至多個氨基酸殘基且具有同等抗旱活性由(I)衍生的蛋白質。以上所說的小麥抗旱基因TaPK的編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列的蛋白質，序列表中的SEQ ID No. 2由514個氨基酸殘基組成。含有本專利技術基因的表達載體、轉基因細胞系、轉基因植株也在本專利技術的保護范圍之內。擴增TaPK中任一片段的引物對也在本專利技術的保護范圍之內。本專利技術的保護范圍還包括基因TaPK在培育抗旱植物中的應用，該植物為小麥或煙草。提高含有小麥TaPK基因的轉基因植物抗旱性的方法，是將小麥基因TaPK導入宿主植物的細胞、組織或植株個體，得到具有抗旱性能的植株。提高含有權利要求I中所述小麥TaPK基因的轉基因植物抗旱性的方法，其特征在于，所述的小麥的抗旱基因TaPK通過含有所述小麥的抗旱基因TaPK的植物表達載體pCAMBIA-2301/TaPK導入細胞、植物組織或植物個體，用于構建所述植物表達載體的出發載體為 pCAMBIA-2301。 0015以上所說的植物宿主為小麥或煙草。本專利技術的有益效果在于，克隆得到了小麥抗旱相關基因TaPK，并通過根癌農桿菌介導的方法將該基因轉入煙草，經過比較分析證明，與野生型煙草植株相比，含有本專利技術的TaPK基因的轉基因煙草植株的抗旱能力明顯提高。附圖說明圖I為小麥樣品的cDNA-AFLP的部分擴增結果，A :部分引物選擇性擴增產物；B A中方框的放大圖，箭頭所示為差異表達片段。M :DNA分子量Marker，下同；CK :正常灌水處理；D :干旱脅迫處理。 圖2為TaPK基因全長cDNA序列的擴增結果，CK :陰性對照；1 :正常灌水處理；2 :干旱脅迫處理；3 :干旱復水處理。 圖3為構建的植物表達載體pCAMBIA-2301/TaPK的酶切驗證結果，I pCAMBIA-2301/TaPK 酶切產物；2 pCAMBIA-2301/TaPK 質粒對照。 圖4為轉基因煙草的PCR鑒定，WT :野生型煙草；1，2，3 :轉TaPK基因煙草。 圖5為轉基因煙草的抗旱鑒定，A :野生型煙草干旱18天后的表型；B :轉TaPK基因煙草干旱18天后的表型。具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例ITaPK基因的克隆I、實驗材料處理本實驗室利用cDNA-AFLP技術分析新疆春小麥主栽品種新春6號(典型既抗旱又具備高水分利用效率的品種)在兩葉一心時期水分脅迫下基因表達的差異，獲得了一些可能與小麥抗旱和水分高效利用相關的基因表達序列標簽，如附圖I。通過測序及序列分析，發現其中一個上調序列與丙酮酸激酶基因具有很高的同源性，預測丙酮酸激酶基因在小麥抗旱過程中可能發揮一定的作用。因此，以春小麥品種新春6號為實驗材料，采用室內盆栽種植，苗期兩葉一心時，進行自然干旱處理，對照材料正常澆水；干旱處理葉片萎蔫時(6d)，剪取對照及部分干旱處理的葉片，于液氮中速凍，-70°C冰箱保存。2、RNA提取及cDNA合成RNA 提取采用 TRizol 法。 (1)取約0.Ig幼葉,在液氮預冷的研缽中迅速磨成粉末狀,移入裝有ImL Trizol試劑的2. OmL離心管中。 (2)振蕩混勻15-30S,平放離心管在冰上5min,4°C, 12000rpm離心lOmin。 (3)取上清于2mL離心管中，加入與上清等體積的氯仿/異戊醇(24 I)上下顛倒混勻，4°C, 12000rpm 離心 IOmin0 (4)取上清至I.5mL離心管中，加入與上清等體積的預冷異丙醇，混勻后室溫放置lOmin, 4°C，12000rpm 離心 IOmin0(5)棄上清，加入ImL預冷的75%乙醇洗滌RNA沉淀，4°C，12000rpm離心lmin。 (6)棄上清，用槍吸取剩余殘液，超凈臺中，冰上干燥RNA沉淀5-10min，加入30yLl%的DEPC水溶解RNA，_70°C保存備用。cDNA的合成使用Takara的cDNA合成試劑盒進行,方法步驟按照試劑盒的說明進行 (1)將RNA溶液于65°C加熱5min后迅速置于冰上，可以減弱二級結構的影響，提高反轉錄效率。 (2)在0.2mL離心管中加入下列試劑RNA5 卩 L 5XI st strand synthesis buffer 4 jiL dNTP mixture I RNase inhibitor I \xL 01igo(dT)I8 2ML Riverse transcriptase(M-MLV)(200U/fiL) 0.8 (xL RNase-free H Q_6 fiL total20 ^iL (3)輕柔攪拌混勻 (4)室溫放置IOmin后，移至42°C恒溫水浴鍋內。(5)42°C反應 Ih。 (6)反應結束后置于冰上冷卻2min。 (7)在上述離心管內，按下列順序配制cDNA第二鏈反應液 I st strand cDNA20 (iL 5 X2nd strand synth本文檔來自技高網...
【技術保護點】
小麥的抗旱基因TaPK，其cDNA序列是序列表SEQ?ID?No.1的核苷酸序列。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王重，張躍強，樊哲儒，李劍峰，海熱古麗·阿不力孜，王子霞，張宏芝，
申請(專利權)人：新疆農業科學院核技術生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：
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