本發明專利技術屬于水稻基因工程技術領域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠控制水稻葉夾角基因ILA1。本發明專利技術采用篩選T-DNA插入水稻突變體庫的方法，克隆到控制水稻葉夾角基因ILA1，通過共分離分析、細胞學觀察、基因表達部位分析表明ILA1是控制水稻葉夾角表型的關鍵基因。所述的ILA1基因具有如序列表SEQ?NO：1中第50-1744位所示的核苷酸序列。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及水稻基因工程領域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠控制水稻葉夾角基因ILA1。本專利技術采用篩選T-DNA插入水稻突變體庫的方法，克隆到控制水稻葉夾角基因ILA1，通過共分離分析、細胞學觀察、基因表達部位分析表明ILAl是控制水稻葉夾角表型的關鍵基因。
技術介紹
水稻是亞洲最重要的糧食作物同時也是一種模式植物。而在未來的40年，水稻的產量必須增長50%才能滿足人口增長的需要。在眾多影響產量的因素中，葉片的光合作用被認為對增加產量起到很重要的作用。對于水稻而言，葉片夾角、葉片溫度和葉片衰老是影 響葉片光合作用的三個主要因素。葉片夾角是指葉片偏離垂直面的角度。擁有小的葉夾角、直立的葉片是新水稻品種的一個重要指標，被命名為NPT (new plant type)。總之，合適的葉夾角能減少植株陰影、增加群體透光性、充分發揮中下層葉的光合潛力、在密植的情況下減少占地面積。近年來的研究表明葉夾角與植物激素和環境有密切的關系。油菜素內酯(BR)是一種多羥基化的固醇類激素，廣泛參與植物生長發育等多種生理過程。水稻對BR的一個最顯著的反應就是葉夾角變大(Wada 等· Brassinolide and Homobrassinolide Promotionof Lamina Inclination of Rice Seedlings. Plant Cell Physiol, 1981, 22 :323-325.)。BR會引起近軸面細胞的快速分裂和生長，從而導致水稻葉夾角的增大(Cao H, ChenS.Brassinosteroid-induced rice lamina joint inclination and its relation toindole-3-acetic acid and ethylene. Plant Growth Regul, 1995,16 :189-196.),也會促進胚芽鞘的生長和根變短(Yamamuro 等.Loss of function of a rice brassinosteroidinsensitivel homolog prevents internode elongation and bending of the laminajoint. Plant Cell，2000，12 :1591-1606.)。生長素是植物中第一個發現的激素，研究發現生長素與BR有相互促進的作用。生長素引起的葉夾角的變化與與BR類似。Song等報道過在水稻中超表達OsIAAl使葉夾角變大、植株株高變矮，呈現典型的BR相關的表型。TLDl編碼IAA氨基合成酶，TLDl功能獲得突變體的表型為分蘗增多、葉夾角變大和矮化。水稻的葉是由葉片和葉鞘組成，中間由葉枕連接，維管束在這三個組織中平行排布，厚壁細胞分布在維管束周圍，被認為是支撐葉的最主要的細胞。葉片或葉鞘中厚壁細胞的減少或者變薄會直接導致植株變脆或柔韌。葉夾角的改變也與光照強度和光性質有關，光依賴的葉夾角變化是通過光敏色素和ABA合成介導的。葉夾角與緯度的關系也被研究過，例如，擬南芥不同生態型的葉片在低緯度上表現得更加直立。
技術實現思路
本專利技術的目的涉及一個MAPKKK家族基因ILAl基因在控制水稻葉夾角改良中的應用。從水稻T-DNA突變體庫中分離得到一個葉夾角變小的水稻T-DNA突變體，其插入基因是一個MAPKKK基因，基于這個突變體的表型，申請人將該基因命名為ILAl (increasedleaf anglel)。本專利技術分離和應用一種包含ILAl基因的DNA片段。其中，所述的ILAl基因是下列核苷酸序列之一I)序列表SEQ NO 1中第50-1744位所示的DNA序列；或2)編碼與I)編碼的蛋白質相同的蛋白質的DNA序列；或3) I)和2)所包含的亞片斷。下面結合附圖和實施例對本專利技術做進一步說明。附圖說明序列表SEQ ID NO 1顯示的是本專利技術分離克隆的包含有ILAl基因編碼區的核苷酸序列。圖I.根據插入位點設計引物驗證共分離示意圖。A表示在插入位點上游設計的引物，B表示在插入位點下游設計的引物，C表示根據T-DNA內部序列設計的引物。在TI代植株中，純合突變體只有A和C配對可以擴增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產物太大無法得到擴增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴增得到產物。圖2.根據插入位點設計引物驗證共分離的PCR結果。上一行引物A+B，下一行引物:〇+8，其中泳道3，4，8，10，14，16，18，20，21為1'-0嫩純合;1，9，19 為 T-DNA 雜合；2，5，6，7，11，12，13，15，17，為 T-DNA 陰性。圖3. ilal突變體表型。A圖為野生型水稻植株中花11 (ZHll)與突變體(ilal)在抽穗時的表型圖為野生型植株與突變體的葉片夾角的比較圖4.水稻中花Il(ZHll)與ilal葉枕的橫切面的比較。箭頭顯示厚壁細胞。圖5. ilal葉枕細胞壁組分測定。X-軸是測定組分，分別為鼠李糖(Rhamnose)，巖藻糖(Fucose),阿拉伯糖(Arabinose),木糖(Xylose),甘露糖(Mannose),半乳入糖(Galactose),葡萄糖(Glucose)、纖維(Cellulose).圖6. pDX2181-ILAlP 載體圖譜。圖7. ILAl基因的啟動子表達模式。圖中顯示葉枕部位⑶S特異表達。具體實施例方式以下實施例定義了本專利技術，并描述了本專利技術在分離ILA1T-DNA突變體，鑒定表型的方法。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本專利技術的基本特征，并且在不偏離本專利技術精神和范圍的情況下，可以對本專利技術做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。實施例I :分離ILAl T-DNA突變體基于已報道的植物MAPK/MAPKK/MAPKKK蛋白質序列建立隱馬爾可夫模型(HMMs Hidden Markov model profiles, 一種軟件，參見http://onlinelibrary. wiley. com/doi/10. 1002/0471219282. eotll4/full)然后用HMMER掃描水稻全基因組，得到水稻基因組里所有可能的MAPKKK基因。然后從水稻突變體庫(http://rmd.ncpgr.cn/)中挑取相應的T-DNA突變體。本專利技術所涉及的序列來源于NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/),TIGR (http: //www. tigr. org)，KOME (http: //cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以“TIGR Rice Annotation Release 4” 為準。其中ILAl T-DNA突變體的側翼序列為AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCCTGCACCTATTTTTGGCTCTACCACAGCCCTTAAGGCTCTTGTTCGTCAAGCAAGCAGCAAGAACCTCCTGGATGACAACCAAGACATAGAT本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種控制水稻葉夾角的基因ILA1在水稻遺傳改良中的應用，其特征在于，該基因的核苷酸序列如序列表SEQ?NO：1中第50?1744位所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：熊立仲，寧婧，周奕華，張保才，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
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